Biotransformación y bioaccesibilidad de ingredientes activos de Radix Astragali de Poria cocos durante la solidez

Apr 22, 2024

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 6888 (2023) Citar este artículo

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Radix Astragali es uno de los complementos alimenticios saludables y medicamentos a base de hierbas más famosos y utilizados. Entre los más de 227 componentes de Radix Astragali, Astragaloside IV (AG IV) es un compuesto funcional famoso y se usa comúnmente como marcador de calidad para Radix Astragali. Sin embargo, el contenido relativamente bajo de AG IV en Radix Astragali (< 0,04%, p/p) limita gravemente su aplicación. El propósito de este estudio es mejorar la biotransformación de AG IV y su bioaccesibilidad durante la digestión in vitro por Radix Astragali fermentador sólido de Poria cocos. Las condiciones óptimas de fermentación fueron las siguientes: Cantidad de inoculación 8 mL; tiempo de fermentación 10 d; Humedad de fermentación 90%. Mediante fermentación, el contenido de AG IV aumentó 5,16 veces de 384,73 a 1986,49 µg/g. Después de la digestión in vitro, los contenidos de genistina, calicosina, formononetina, AG IV, astragalósido II (AG II) y flavonoides totales en Radix Astragali fermentado (FRA) de fase entérica II (ENTII) fueron 34,52 μg/g, 207,32 μg/g. , 56,76 μg/g, 2331,46 μg/g, 788,31 μg/g, 3,37 mg/g, que fueron 2,08 veces, 2,51 veces, 1,05 veces, 8,62 veces, 3,22 veces y 1,50 veces mayores que los de controlar, respectivamente. La microscopía electrónica de barrido (SEM) de FRA mostró una superficie rugosa y una estructura porosa. La tasa de eliminación de radicales de DPPH y ABTS de FRA fue mayor que la del control. Estos resultados mostraron que la fermentación sólida de Poria cocos podría aumentar el contenido de AG IV en Radix Astragali y mejorar la bioaccesibilidad y la actividad antioxidante de Radix Astragali, lo que está proporcionando nuevas ideas para el futuro desarrollo y utilización de Radix Astragali.

Radix Astragali es la raíz seca de Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao o A. membranaceus (Fisch.) Bge. en la familia de las leguminosas. Es una medicina tradicional famosa y un complemento alimenticio saludable en China con efectos beneficiosos para la salud humana1. Además, se aplica ampliamente como aditivo para la salud en alimentos, tés, bebidas, vinos, etc. Radix Astragali es abundante en compuestos biológicamente activos, como astragalósidos, flavonoides, polisacáridos y diversos oligoelementos2. Entre ellos, AG IV es el compuesto más importante por sus actividades farmacológicas y eficacia terapéutica. Los estudios farmacológicos modernos han demostrado que tiene buenos efectos sobre el sistema cardiovascular, inmunológico, digestivo y nervioso. Hubo muchos efectos terapéuticos para AG IV, como efecto antiinflamatorio, antifibrótico, antioxidante, antiasma, antidiabetes, inmunorregulador y cardioprotector3,4. Sin embargo, la tasa de extracción de AG IV en Radix Astragali está limitada por la tecnología de producción convencional. Y hay mucha lignina, celulosa y pectina estrechamente unidas a compuestos bioactivos en Radix Astragali y estas sustancias inhiben la liberación de compuestos bioactivos en el sistema digestivo. Por lo tanto, para resolver este problema, se dedican algunos estudios al fermento microbiano Radix Astragali. La fermentación microbiana puede producir un sistema multienzimático, que puede transformar los otros astragalósidos en AG IV5. Por otro lado, las enzimas pueden hidrolizar la lignina, celulosa y pectina de Radix Astragali6, lo que puede promover la liberación de AG IV.

Poria cocos es el esclerocio seco de Poria cocos (Schw.)Wolf., que es un importante hongo comestible y medicinal. Tiene una larga historia de uso medicinal en China y otros países asiáticos7. Las investigaciones han demostrado que la Poria cocos tiene actividades biológicas descritas como reguladoras de la función inmune, antitumorales y antiinflamatorias, etc8. En las últimas décadas, el cultivo de fermentación de Poria cocos se ha desarrollado debido al potencial para aumentar la producción de micelios y componentes bioactivos en un espacio compacto y en un período más corto. Durante el proceso de fermentación, Poria cocos aprovecha al máximo la celulosa y otros componentes como fuente de carbono para degradar la pared celular de la planta, lo que contribuye a la liberación de los compuestos bioactivos de la planta. Además, como consecuencia de sus valores nutricionales y para la salud, también se aplica como alimento funcional. El uso combinado de Radix Astragali y Poria cocos tiene una larga historia, con el efecto de tonificar el bazo y el riñón. Hasta el momento, no hay informes sobre la fermentación de Radix Astragali utilizando Poria cocos.

Actualmente, las técnicas de digestión in vitro se utilizan comúnmente para estudiar la bioaccesibilidad de hierbas y alimentos con el fin de investigar mejor los cambios fisicoquímicos y el metabolismo de sustancias funcionalmente activas durante la digestión. La fermentación microbiana puede promover la liberación de compuestos bioactivos en el sistema digestivo. Para investigar la bioaccesibilidad y digestión de Radix Astragali antes y después de la fermentación, en el estudio se realizaron experimentos de digestión in vitro. El sistema de digestión in vitro es un modelo in vitro para predecir o evaluar la digestibilidad, bioaccesibilidad, características cinéticas de liberación y cambios estructurales de compuestos basados ​​en procesos fisiológicos del tracto gastrointestinal humano y simular la digestión y absorción in vivo en condiciones in vitro. El sistema puede reemplazar total o parcialmente las pruebas in vivo y tiene las ventajas de ahorro de costos, ciclos de prueba más cortos, precisión y monitoreo manual.

En este estudio, Radix Astragali fue fermentado por Poria cocos y se utilizó digestión in vitro y técnica antioxidante para investigar la bioaccesibilidad y la actividad antioxidante antes y después de la fermentación del hongo, lo que proporcionó una nueva idea para la investigación futura de Radix Astragali.

Se realizó un estudio a lo largo del tiempo sobre la acumulación masiva de Poria cocos cultivada en 100 ml de medio líquido de papa de 26,1 g/l. Inicialmente se determinó la cinética de las curvas de crecimiento de Poria cocos (Fig. 1). De 2 a 6 días, el peso seco del micelio aumentó rápidamente, que es la fase logarítmica de Poria cocos. Al sexto día, la tendencia de crecimiento de Poria cocos tiende a estabilizarse. Los picos ocurrieron a los 7 d. Más allá de los 7 días, el cultivo entró en una fase de senescencia. Al séptimo día, el cultivo alcanzó la máxima acumulación de masa y la producción de metabolitos secundarios alcanzó su máximo. Según la curva de crecimiento de Poria cocos para determinar el tiempo de incubación de Poria cocos9.

Curvas de crecimiento de Poria cocos.

Los flavonoides y las saponinas son los ingredientes activos básicos de los extractos de plantas. El contenido de compuestos de flavonoides y saponinas presentes en el extracto de fermentación de Radix Astragali se determinó mediante espectrofotómetro y HPLC. Después de la fermentación aumentaron los contenidos de AG IV y genisteína. Los factores relacionados con Radix Astragali fermentado sólido de Poria cocos incluyen la cantidad de inoculación, el tiempo de fermentación y la humedad de fermentación. La influencia de cada factor se estudió mediante experimentos de un solo factor. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

El efecto de la cantidad de inoculación sobre la fermentación se estudió en condiciones de temperatura de fermentación de 27 °C, tiempo de fermentación de 7 días y humedad de fermentación del 90%. La cantidad de inoculación osciló entre 4 y 9 ml para la prueba de optimización de factor único (Tabla 1). Después de la fermentación, el contenido de flavonoides, saponinas y otros componentes activos en Radix Astragali mostró tendencias diferentes. Los contenidos de calicosina-7-O-β-d-glucopiranósido (calicosina-glu), ononina, calicosina y formononetina se redujeron significativamente. El contenido de saponinas totales cambió poco y el contenido de flavonoides totales aumentó. A medida que la cantidad de inoculación aumentó de 4 a 8 ml, aumentaron los contenidos de genisteína y AG IV. Cuando la cantidad de inoculación superó los 8 ml, el contenido de ambos compuestos disminuyó. La reducción del contenido de calicosina-glu y otros componentes puede deberse a las enzimas hidrolíticas producidas por Poria cocos. Estos componentes se convirtieron aún más en otros metabolitos secundarios o moléculas más pequeñas10. La Poria cocos en el proceso de crecimiento y reproducción puede producir algunas enzimas que pueden degradar la celulosa, pectina y otras sustancias en la pared celular de Radix Astragali y facilitar la liberación de componentes químicos. El aumento del contenido de AG IV puede deberse al metabolismo o biotransformación de otros astragalósidos como precursores en el proceso de fermentación11. Con el aumento de la cantidad de inoculación, disminuyó el contenido de AG IV y otros componentes. Por lo tanto, se eligió 8 ml de caldo de fermentación de semillas como cantidad óptima de inoculación.

El efecto del tiempo de fermentación se estudió en condiciones de temperatura de fermentación de 27 °C, cantidad de inoculación de 8 ml y humedad de fermentación del 90%. El tiempo de fermentación osciló entre 6 días y 11 días para el experimento de optimización de un solo factor (Tabla 2). Los cambios en el contenido de flavonoides, saponinas y otros ingredientes activos en Radix Astragali después de la fermentación fluctuaron. Los contenidos de calicosina-glu, ononina, calicosina, formononetina y AG II se redujeron significativamente después de la fermentación. El contenido de saponinas totales fue menor que el del control y el contenido de flavonoides totales aumentó. Con el aumento de los días de fermentación, los contenidos de genistina y AG IV aumentaron primero y luego disminuyeron. El contenido máximo de genistina fue de 34,75 μg/g el séptimo día y el contenido máximo de AG IV fue de 775,79 μg/g el décimo día de fermentación. Poria cocos creció y se metabolizó vigorosamente en la etapa inicial de fermentación. Sin embargo, con el aumento de los días de fermentación, la cepa envejeció gradualmente, el consumo de nutrientes aumentó y los metabolitos se redujeron12. A los 10 días, la acumulación masiva del contenido de AG IV alcanzó el máximo, por lo que se eligió 10 días como el tiempo óptimo de fermentación.

La humedad de fermentación se investigó usando diferentes humedades (por ejemplo, 65%, 90%, 115%, 140% y 165%) en condiciones de temperatura de fermentación de 27 °C, cantidad de inoculación de 8 ml, tiempo de fermentación de 10 días (Tabla 3). Con el aumento de la humedad, los contenidos de AG IV, AG II y flavonoides totales aumentaron y luego disminuyeron, y el contenido de genistina aumentó significativamente. El contenido más alto de genisteína fue de 48,65 μg/g con una humedad del 165% y el contenido más alto de AG IV fue de 1986,49 μg/g con una humedad del 90%. La Tabla 3 mostró que con el aumento de la humedad del 65 al 90%, el contenido de AG IV aumentó gradualmente. Sin embargo, con el aumento de la humedad al 165%, el contenido de AG IV se redujo. Quizás el aumento de la humedad de la fermentación redujo la densidad de las cepas, liberó la inhibición de contacto de Poria cocos, lo que ayudó al crecimiento y metabolismo de Poria cocos. Sin embargo, demasiada agua provocó que el residuo de Radix Astragali produjera pegajosidad, lo que produjo una permeabilidad deficiente y un ambiente con menos oxígeno disuelto para Poria cocos. No favoreció el crecimiento y el metabolismo de Poria cocos. Debido a que el contenido de AG IV aumentó más cuando la humedad era del 90%, se eligió el 90% como la humedad óptima de fermentación.

En los experimentos de fermentación de un solo factor, los cambios en el contenido de flavonoides, saponinas y otros ingredientes activos fluctuaron. Combinados con las curvas de crecimiento de Poria cocos (Fig. 1), los cambios en el contenido pueden deberse al crecimiento de Poria cocos, que influyó en la biotransformación de Radix Astragali. Las condiciones de fermentación provocaron grandes fluctuaciones en el contenido de AG II. Este fenómeno puede ser causado por la biotransformación de saponinas, las otras saponinas primero se convierten en AG II y luego en AG IV13.

Un análisis exhaustivo de los datos tabulares mostró el contenido de AG IV del factor máximo para las condiciones óptimas. Mientras tanto, AG IV se utiliza oficialmente como marcador de calidad para Radix Astragali en la farmacopea china. Las condiciones óptimas de fermentación fueron las siguientes: se agregaron 20 g de Radix Astragali, 90% de humedad y 8 mL de cantidad de inoculación y se fermentó a 27 °C durante 10 días. En las condiciones óptimas de fermentación, el contenido de AG IV fue de 1986,49 μg/g, que fue 5,16 veces mayor que el control.

La bioaccesibilidad se puede definir como la cantidad que se libera de la matriz alimentaria en el tracto gastrointestinal y queda disponible para la absorción. Sin embargo, es difícil estudiar los cambios in vivo de estos componentes durante su paso por el tracto digestivo. Actualmente se considera que la medición in vitro de la bioaccesibilidad es una forma fiable de evaluar la disponibilidad de compuestos dietéticos. El método gastrointestinal simulado in vitro consta de cuatro fases: fase oral (OP), fase gástrica (GP), fase entérica I (ENTI) y ENTII.

La Tabla 4 muestra los efectos de la digestión in vitro sobre los cambios de contenido de los principales componentes efectivos en Radix Astragali antes y después de la fermentación. Los contenidos de genistina, calicosina, formononetina, AG IV, AG II en la FRA aumentaron significativamente, y los contenidos de cada componente en ENTII fueron 34,52, 207,32, 56,76, 2331,46 y 788,31 μg/g, que fueron 2,08 veces, 2,51- veces, 1,05 veces, 8,62 veces y 3,22 veces mayores que los del control, respectivamente. Esto se debe a que la fermentación en estado sólido provocó la destrucción de la pared celular de Radix Astragali, favoreciendo la liberación de flavonoides y saponinas. Por otro lado, la digestión gastrointestinal mejoró significativamente la liberación de componentes eficaces de Radix Astragali. Debido a la acción de las enzimas digestivas gastrointestinales, se destruyeron la estructura celular de Radix Astragali y el enlace químico del grupo acetilo y glicosídico, y se liberaron flavonoides y saponinas combinados14. Los contenidos de glucósido de calicosina y ononina disminuyeron significativamente.

En OP y GP, los contenidos de flavonoides y saponinas de control y FRA tuvieron pocos cambios. Después de sufrir sucesivas digestiones en ENTI y ENTII, los contenidos de flavonoides y saponinas aumentaron, especialmente las saponinas totales aumentaron significativamente. La razón podría deberse al hecho de que los componentes flavonoides y saponinas se encontraban en un ambiente ácido (durante la digestión en el estómago), lo que podría suprimir su liberación, mientras que las enzimas digestivas en el intestino podrían hidrolizar las proteínas para liberar los flavonoides encapsulados en proteínas. o saponinas y pueden existir de manera estable en un ambiente débilmente ácido15.

Los datos de bioaccesibilidad de FRA y el control se muestran en la Tabla 4. La bioaccesibilidad de calicosina, formononetina, AG IV, AG II, saponinas totales y flavonoides totales en FRA fue 274,34 %, 260,61 %, 117,36 %, 83,63 %, 437,83 % y 125,28 % y los del control fueron 53,37%, 90,48%, 70,29%, 45,30%, 245,82% y 96,98%, respectivamente. La bioaccesibilidad de estos componentes en la FRA fue mayor que la del control. Sin embargo, la bioaccesibilidad de calicosina-glu, genistina y ononina en la FRA fue menor que la del control. Estos resultados posiblemente se deban a que los glucósidos tienen gran cantidad de oxihidrilo, que están fuertemente unidos a la celulosa. Después de la fermentación, los Poria cocos produjeron enzimas para hidrolizar la celulosa, que puede liberar los glucósidos. Y el sistema multienzimático producido por Poria cocos podría favorecer la biotransformación de glucósidos. Por otro lado, las enzimas digestivas podrían convertir glucósidos en agliconas durante la digestión in vitro16. Por lo tanto, la bioaccesibilidad de las agliconas en la FRA fue mayor que la del control y la bioaccesibilidad de los glucósidos en la FRA fue menor que la del control.

Es un fenómeno interesante que los contenidos de algunos componentes bioactivos del control y FRA en el experimento de fermentación fueran mayores que los del experimento de digestión in vitro. Por ejemplo, el contenido de calicosina en el control fue de 155,05 µg/g en la Tabla 3 y de 41,08 µg/g en la Tabla 4 del OP. El contenido de calicosina en FRA fue de 75,57 μg/g en la Tabla 3 y de 62,34 μg/g en la Tabla 4 del OP. Por un lado, esto puede deberse a que la solubilidad de los componentes bioactivos en etanol y la solución de digestión fue diferente. Por otro lado, el contenido de calicosina en FRA fue mayor que el del control en OP porque el Radix Astragali fermentado sólido de Poria cocos podría promover la liberación de componentes bioactivos. De esto se puede ver que Radix Astragali fermentado sólido de Poria cocos podría mejorar la bioaccesibilidad de Radix Astragali. En resumen, los experimentos de digestión in vitro validan que FRA tiene una mayor bioaccesibilidad que el control, lo que proporciona información valiosa para FRA en diferentes etapas de digestión.

Las muestras fueron examinadas por EVO LS15 SEM con un aumento de 2000x, para estudiar las alteraciones estructurales de Radix Astragali por fermentación y digestión in vitro. La Figura 2 muestra el control (A), el control en la digestión gástrica (B), el control en la digestión entérica II (C), el FRA (D), el FRA en la digestión gástrica (E), y el FRA en la digestión entérica II (F). La superficie de control era lisa, básicamente sin agujeros y con una pequeña cantidad de partículas adheridas. La Figura 2A indicó que las células de control no fueron obviamente destruidas y aún conservaron la estructura del tejido intacta. Después de la fermentación, las microestructuras se desorganizaron en la Fig. 2D. La superficie de los residuos de FRA era rugosa, porosa y de estructura reticular. Estos resultados pueden deberse a que el micelio de Poria cocos podría ingresar directamente al residuo del medicamento y destruir las células internas de Radix Astragali.

Micrografías electrónicas de barrido de cada muestra de Radix Astragali ((A) el control, (B) el control en la digestión gástrica, (C) el control en la digestión entérica II, (D) el FRA, (E) el FRA en el digestión gástrica, (F) la FRA en la digestión entérica II).

Después de la digestión gástrica, las micrografías electrónicas de ambas muestras cambiaron significativamente. Bajo la acción de la pepsina y el líquido de digestión ácida, la muestra resultó gravemente dañada. La superficie se volvió irregular y se observaron muchas partículas. Como puede verse en la Fig. 2B, E, las muestras de fermentación se destruyeron más seriamente que las muestras de control. Los resultados pueden estar relacionados con la destrucción de Radix Astragali por Poria cocos. Después de la fermentación, la superficie de Radix Astragali mostró una estructura reticular porosa, lo que aumentó el área de exposición e hizo que los ingredientes activos fueran más fáciles de digerir y disolver. Después de la digestión entérica II, ambas muestras se destruyeron fuertemente y las micrografías electrónicas de la Fig. 2C, F no fueron significativamente diferentes de las de la Fig. 2B, E.

Los diversos componentes tienen actividad antioxidante en Radix Astragali. En la fermentación y digestión in vitro, los contenidos de AG IV, AG II, calicosina y genistina mostraron cambios significativos, por lo que sus estándares fueron seleccionados como referencia para los experimentos antioxidantes de Radix Astragali. Aquí, las capacidades antioxidantes del ácido ascórbico (Vc), los extractos de Radix Astragali no fermentados (control), los extractos de FRA y sus productos digestivos in vitro se evaluaron con un ensayo de eliminación de radicales DPPH y un ensayo de eliminación de radicales ABTS.

Los resultados de antioxidante DPPH de extractos y muestras digeridas in vitro de Radix Astragali se muestran en la Fig. 3. El valor IC50 de FRA fue 0,140 mg/mL, que fue mayor que el valor IC50 del Vc de referencia (0,002 mg/mL) y calicosina (0,034 mg/mL), pero superior a la del control (0,367 mg/mL). A 0,4 mg/ml, la tasa de eliminación de radicales libres de DPPH de la muestra, de mayor a menor, fue: Vc 98,25 %, calicosina 87,86 %, FRA 63,81 %, control 51,43 %, FRA (OP) 35,59 %, FRA (ENTII) 35,50 % , FRA (GP) 34,52%, control (OP) 31,96%, FRA (ENTI) 31,94%, control (GP) 29,81%, genistina 24,52%, control (ENTII) 24,72%, control (ENTI) 20,42%, AGII 8,81% y AG IV 7,30%.

Tasa de eliminación de radicales DPPH de cada muestra de Radix Astragali, estándares y Vc.

Los resultados de antioxidantes ABTS de extractos y muestras digeridas in vitro de Radix Astragali se muestran en la Fig. 4. El valor de IC50 de los extractos de FRA fue de 0,064 mg/mL, que fue mayor que el valor de IC50 del Vc de referencia (0,002 mg/mL). , calicosina (0,003 mg/mL) y genistina (0,030 mg/mL) pero superior a la del control (0,207 mg/mL). En el rango de 0,01 a 0,30 mg/ml, la capacidad antioxidante de la muestra aumentó con el aumento de la concentración de masa. A 0,29 mg/ml, la tasa de eliminación de radicales libres de ABTS de la muestra, de mayor a menor, fue: Vc 99,86 %, calicosina 99,28 %, FRA 98,60 %, genistina 87,26 %, FRA (OP) 71,39 %, control 68,72 %, FRA ( ENTI) 65,86%, FRA (ENTII) 64,73%, FRA (GP) 61,76%, control (OP) 46,44%, control (ENTII) 45,73%, control (ENTI) 45,30%, control (GP) 38,46%, AG II 11,14 % y AG IV 7,09%.

Tasa de eliminación de radicales ABTS de cada muestra de Radix Astragali, estándares y Vc.

Después de la fermentación y la digestión in vitro, las capacidades antioxidantes de DPPH y ABTS de FRA fueron mayores que las del control. Sin embargo, la actividad antioxidante de FRA y el control disminuyó después de la digestión in vitro, lo que puede deberse a que el peso del extracto del fluido digestivo fue mayor que el de FRA y el control. Bajo la misma concentración de masa seca, el contenido de componentes antioxidantes en las muestras de antioxidantes disminuyó, lo que afectó la capacidad antioxidante.

En conclusión, se propuso un esquema de fermentación sólida de Radix Astragali con Poria cocos para aumentar los contenidos del principal compuesto activo en Radix Astragali (AG IV). Optimizando el proceso de fermentación se obtienen las mejores condiciones de fermentación: cantidad de inoculación 8 mL; tiempo de fermentación 10 días; Humedad de fermentación 90%. En condiciones óptimas, el contenido de AG IV aumentó 5,16 veces de 384,73 a 1986,49 μg/g. Además, se investigó la bioaccesibilidad de FRA mediante digestión in vitro. Después de la digestión in vitro, los contenidos de genistina, calicosina, formononetina, AG IV, AG II y flavonoides totales de FRA en ENTII fueron 34,52 μg/g, 207,32 μg/g, 56,76 μg/g, 2331,46 μg/g, 788,31 μg/ g, 3,37 mg/g, que fueron 2,08 veces, 2,51 veces, 1,05 veces, 8,62 veces, 3,22 veces y 1,50 veces mayores que los del control, respectivamente. Y la bioaccesibilidad de calicosina, formononetina, AG IV, AG II, saponinas totales y flavonoides totales de la FRA fue 274,34%, 260,61%, 117,36%, 83,63%, 437,83% y 125,28% y las del control fueron 53,37%, 90,48 %, 70,29%, 45,30%, 245,82% y 96,98%, respectivamente. Como se observó a través de SEM, la superficie de FRA y su residuo de digestión in vitro era rugosa y porosa, parecía una estructura reticular más clara y el área de superficie aumentó que el control. En el ensayo de eliminación de radicales DPPH y ABTS, el valor de CI50 de FRA fue de 0,140 mg/ml y 0,064 mg/ml, que fueron superiores al del control (0,367 mg/ml, 0,207 mg/ml). Estos resultados mostraron que el antioxidante de FRA era mayor que el del control. Después de la digestión in vitro, los FRA todavía tienen una buena actividad antioxidante. En este estudio, se utilizó Poria cocos para fermentar Radix Astragali por primera vez para completar la biotransformación de los componentes bioactivos. La FRA tiene una alta biodisponibilidad y una fuerte actividad antioxidante, lo que sentó las bases para el desarrollo y utilización de Radix Astragali.

Radix Astragali, la raíz seca de Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao fue adquirido de Shanxi Hunyuan Wansheng Huangqi Development Co., Ltd (Shanxi, China) y autenticado por el Prof. Ying Lin de la Universidad Médica de Binzhou (Yantai, Shandong). Los especímenes de vale se depositaron en el herbario del Centro Experimental de Medicina China de la Universidad Médica de Binzhou y el número de acceso fue 2021-1003. Radix astragali se pulverizó con un desintegrador 800A (Planta de instrumentos médicos y hardware de Yongkang, China) y se pasó a través de un tamiz de malla para obtener un polvo fino con un tamaño de partícula de 600 μm. Poria cocos (bio-08656) se adquirió de Beijing Bai Ou Bo Wei Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China). El ácido fórmico, el metanol y el acetonitrilo de calidad cromatográfica se adquirieron en Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. (Tianjin, China). El agua ultrapura utilizada en todo el experimento se purificó mediante un sistema de purificación de agua Milli-Q de Millipore (Bedford, MA, EE. UU.). El medio PDA y el medio líquido de papa se adquirieron de Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd. (Qingdao, China). El fosfato de potasio, el dihidrogenofosfato de potasio, el carbonato de sodio, el persulfato de potasio y el hidróxido de sodio se adquirieron de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). La amilasa salival (BR, 4000u/g), la pepsina (grado USP, 1:3000), la lipasa gástrica (BR, 30.000u/g), la enzima pancreática (BR, 1600u/g) y la bilis de cerdo en polvo (BR) se adquirieron en Shanghai Yuanye Biotech Co. (Shanghái, China). La sal diamina de 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo y 2,2-hidrazina-bis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) se adquirió de Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd. (Shanghai, China). El nitrito de sodio se adquirió de Tianjin Bodi Chemical Co., Ltd. (Tianjin, China). El nitrato de aluminio se adquirió de Shanghai walkai Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China), y el etanol anhidro se adquirió de Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., Ltd. (Tianjin, China). La vainillina se compró en el Instituto de Investigación de Química Fina Guangfu de Tianjin. Rutina (≥ 98%), Ononina (≥ 98%), Genistin (≥ 98%), Calycosin (≥ 98%), Calycosin-glu (≥ 99%), Formononetin (≥ 99%), AG II (≥ 98% ) y AG IV (≥ 98%) se adquirieron de Chengdu Pusi biotech Co. (Chengdu, China).

Todos los métodos de este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes de la Farmacopea de la República Popular China.

Se inoculó Poria cocos en la placa de cultivo con 46,0 g/l de medio PDA, hasta que el micelio se extendió por toda la placa de cultivo. Luego, el micelio inoculado se cultivó en 100 ml de medio líquido de papa de 26,1 g/l en una incubadora con agitador ZQPW-70 (Tianjin Laboratory Instrument Equipment Co., Ltd, Tianjin, China) a 27 °C, 180 rpm durante 2 días. 10 días. Después de la incubación, los micelios se lavaron con agua durante la filtración. Las muestras se colocaron en una estufa a 60 ℃ hasta peso constante y luego se midió el peso seco de los micelios. Cada grupo tenía tres muestras paralelas.

Se agregaron veinte gramos de polvo de Radix Astragali y entre 5 y 25 ml de agua ultrapura a las bolsas de fermentación. La mezcla se puso en un autoclave YXQ-Sll (Shanghai Boxun Medical Biological Instrument Co., Ltd, Shanghai, China) a 121 °C durante 25 min. Después de eso, se inocularon entre 4 y 9 ml de caldo de fermentación de semillas en el polvo medicinal de la bolsa de fermentación. Luego, la mezcla se incubó en una incubadora de temperatura y humedad constante GSP-9160MBE (Shanghai Boxun Medical Biological Instrument) a 27 °C durante 6 a 11 días. Cada grupo tenía tres muestras paralelas. La fotografía del producto de Radix Astragali fermentado por Poria cocos se muestra en la Fig. 5A. Los experimentos de control fueron polvo de Radix Astragali únicamente con tratamiento en autoclave sin Poria cocos. Y el agua ultrapura reemplazó el caldo de fermentación de semillas para mantener el mismo nivel de humedad.

Foto de Radix Astragali fermentado de Poria cocos ((A) el Radix Astragali fermentado, (B) los pequeños trozos de FRA, (C) el polvo de FRA).

El método gastrointestinal simulado in vitro consta de cuatro fases: fase oral OP, GP, ENTI y ENTII.

El FRA (Fig. 5A) se rompió en trozos pequeños (Fig. 5B) y se secó a 60 °C. Las muestras secas se trituraron hasta convertirlas en polvo utilizando un desintegrador y se pasaron a través de un tamiz de malla 60 (Fig. 5C).

Se agregaron cinco gramos de la muestra fermentada y el control a diferentes botellas cónicas después de la esterilización. Se añadieron diez mililitros de tampón de ácido fosfórico de 20 mmol/l, se añadió solución salina normal al 0,9 % a 125 ml, se ajustó el valor del pH a 7,0 con una solución de NaOH de 1 mol/l y se mantuvo a 37 °C durante 10 min. Finalmente, se agregaron 0,2 mg de amilasa salival y se mezclaron uniformemente. Y poner en un oscilador de baño de agua a temperatura constante precalentado a 37 ° C, 55 rpm durante 2 min en la oscuridad. Se digirieron cuatro grupos al mismo tiempo. Después de la digestión, se calentaron hasta ebullición en agua durante 2 min. Se almacenó un grupo y los 3 grupos restantes se continuaron para la siguiente etapa de digestión. Tres muestras paralelas para cada grupo.

Después de la digestión oral, los tres grupos restantes de muestras de digestión se agregaron a 125 ml con solución salina normal al 0,9%. El valor del pH se ajustó a 2,0 con una solución de HCl de 1 mol/L después de mezclar y se mantuvo durante 10 minutos a 37 °C en un oscilador de baño de agua a temperatura constante. Luego, se añadieron 0,375 g de pepsina y 0,1125 mg de lipasa y se mezclaron bien. Y poner en un oscilador de baño de agua a temperatura constante precalentado a 37 °C, 150 rpm, durante 2 h en la oscuridad. Después de la digestión, se calentaron hasta ebullición en agua durante 2 min. Se almacenó un grupo y los dos grupos restantes se continuaron para la siguiente etapa de digestión.

Refiriéndose a la investigación de Ningtyas, et al.14, la fase de digestión entérica se dividió en dos fases: ENTI y ENTII.

Después de la digestión gástrica, los dos grupos restantes de muestras de digestión se agregaron a 125 ml con solución salina normal al 0,9%. El valor del pH se ajustó a 4,7 con una solución de NaOH 1 mol/L y la muestra se mantuvo durante 10 min a 37 °C. Luego se añadieron 0,125 g de tripsina y 1,25 g de bilis y se mezclaron bien. La etapa entérica I se digirió durante 2 h a 37 °C durante 150 rpm en un oscilador de baño de agua en condiciones de oscuridad. Después de la digestión, se calentaron hasta ebullición en agua durante 2 min. Se almacenó un grupo y se continuó con el otro para la siguiente etapa de digestión.

El último grupo de muestra digerida se añadió a 125 mL de la misma manera, se ajustó el pH a 6,5 ​​con solución de NaOH 1 mol/L y se mantuvo durante 10 min a 37 °C. Luego se añaden 0,125 g de tripsina y 1,25 g de bilis y se mezclan bien. La etapa entérica II se digirió durante 2 h a 37 °C durante 150 rpm en un oscilador de baño de agua en condiciones de oscuridad. Después de la digestión, se calentó hasta ebullición en agua durante 2 minutos y se almacenó.

Las muestras almacenadas de cada etapa de digestión se centrifugaron a 12.000 rpm durante 5 min a 4 °C. El sobrenadante se recogió y se utilizó para determinar la composición química. El resto del residuo se secó a 60 °C y se usó para SEM.

La bioaccesibilidad se consideró como la concentración de compuestos bioactivos liberados de la matriz alimentaria mediante digestión entérica in vitro. La bioaccesibilidad se calcula según la siguiente ecuación:

donde BCdigerido y BCno digerido corresponden a la concentración del compuesto bioactivo en Radix Astragali digerido y no digerido, respectivamente.

Se pesaron con precisión cinco g de muestra y se agregaron 100 ml de etanol al 70% a un matraz cónico. La mezcla se extrajo mediante baño de ultrasonido durante 60 min con una potencia de 100 W. Las muestras extraídas se filtraron y centrifugaron a 12.000 rpm durante 5 min a 4 °C. El sobrenadante se recogió y se utilizó para determinar la composición química.

El contenido total de flavonoides se determinó siguiendo los métodos de Liu et al.17, y se modificó ligeramente. Se utilizó rutina como estándar para la curva de calibración. La rutina se disolvió en etanol con una concentración inicial de 0,2 mg/ml. Los diferentes volúmenes de la solución madre con 0, 0,2, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0 y 2,4 mL se transfirieron a matraces aforados de 10 mL y se les agregaron 2 mL de etanol al 70%. Se agitó uniformemente, se agregaron 0,3 ml de solución de NaNO2 al 5 % y se mantuvo durante 6 min. Luego, se agregaron 0,3 ml de solución de AlCl3 al 10 % y la mezcla se agitó uniformemente y se mantuvo durante 6 min. Después de eso, se agregaron 4 ml de la solución de NaOH al 4% en el matraz aforado. La mezcla se fijó en volumen a escala con etanol al 70% y se mantuvo durante 15 min. La absorbancia de estas mezclas se midió a 510 nm utilizando un espectrofotómetro UV-Visible TU-1810 APC (Beijing Persee General Instrument Co., Ltd, Beijing, China) y se estableció la curva estándar.

Se transfirieron tres mililitros de la solución de muestra preparada anteriormente a matraces volumétricos de 10 ml. La absorbencia de la muestra se determinó mediante el método colorimétrico como se describe anteriormente.

El contenido total de saponinas se determinó siguiendo los métodos de 18 y se modificó ligeramente. Se utilizó AG IV como estándar para la curva de calibración. Se disolvió AG IV en etanol con una concentración inicial de 0,5 mg/ml. Los diferentes volúmenes de la solución madre con 0,00, 0,05, 0,10, 0,20, 0,30, 0,40 mL se transfirieron a matraces aforados de 10 mL y se les añadió etanol al 70% hasta 0,5 mL. Se agitó uniformemente y se añadieron 0,5 ml de solución de etanol de vainillina al 8 % y 5,0 ml de ácido sulfúrico al 72 %. Después de mezclar uniformemente, la mezcla de reacción se incubó a 62 ℃ durante 20 min. Luego, la mezcla se enfrió en un baño de agua helada hasta temperatura ambiente. La absorbancia de estas mezclas se midió a 540 nm utilizando un espectrofotómetro UV-Visible TU-1810 APC y se estableció la curva estándar.

La solución de muestra (0,5 ml) preparada anteriormente se transfirió a matraces volumétricos de 10 ml. La absorbencia de la muestra se determinó mediante el método colorimétrico como se describe anteriormente.

Los flavonoides del astrágalo se analizaron mediante HPLC, utilizando un sistema de HPLC Thermo Scientific Dionex Ultimate serie 3000 (Dionex, EE. UU.), un detector de matriz de diodos (Dionex, EE. UU.) y una columna Kromasil 100–5-C18 (4,6 por 250 mm). La temperatura de la columna se mantuvo a 30 °C con un volumen de inyección de 10 µl. La fase móvil consistió en ácido fórmico al 0,05% en agua (A) y acetonitrilo (B) utilizando la siguiente secuencia de elución en gradiente: 0–5 min, 0–5% B; 5 a 10 min, 5 a 20 % B; 10 a 25 min, 20 a 25 % B; 25 a 35 min, 25 a 30 % B; 35 a 40 min, 30 a 35 % B; 40 a 54 min, 35 a 40 % B; 54–55 min, 40–0% B. El caudal se fijó en 1 ml/min. Los flavonoides se detectaron y cuantificaron monitoreando la absorbancia a 254 nm, incluyendo calicosina-glu, genistina, ononina, calicosina y formononetina, sus fórmulas moleculares y estructuras químicas se muestran en la Tabla 5. Las concentraciones de los diferentes analitos se determinaron de acuerdo con el estándar correspondiente. curvas. Las ecuaciones de regresión fueron y1 = 640,7x−0,1856 (R2 = 0,9994, n = 6); y2 = 886,38x−0,2805 (R2 = 0,9995, n = 6); y3 = 746,76x−0,2932 (R2 = 0,9995, n = 6); y4 = 995,48x−0,383 (R2 = 0,9995, n = 6); y5 = 1234x−0,5045 (R2 = 0,9994, n = 6), donde y era el área del pico del analito y x era la concentración del analito (mg/mL).

Para la determinación de AG IV y AG II se utilizó un sistema HPLC DGU-20A3R (SHIMADZU, Japón) acoplado con un ELSD-16 (SHIMADZU, Japón), cuyas fórmulas moleculares y estructuras químicas se muestran en la Tabla 5. Las separaciones cromatográficas se realizaron en una columna Phenomenex C18 (4,60 × 250 mm, 5 μm) mantenida a temperatura ambiente. Las fases móviles consistieron en acetonitrilo (A) y agua (B) con un gradiente de elución de la siguiente manera: 0–20 min, 96–80% B; 20 a 40 min, 80 a 70 % B; 40 a 65 min, 70 a 40 % B; 65 a 70 min, 40 a 96 % B; 70–80 min, 96 % B. Se empleó un caudal constante de 1,0 ml/min. La temperatura del tubo de deriva del ELSD se fijó en 100 °C y el caudal del gas portador fue de 2,5 l/min. El volumen de inyección de muestra fue de 20 μL. Las ecuaciones de regresión para AG IV y AG II fueron y6 = 1,5346x + 0,3752 (R2 = 0,9980, n = 6); y7 = 1,644x + 0,1816 (R2 = 1,0000, n = 6), donde y era el área del pico del analito y x era la concentración del analito (mg/ml).

Se utilizó un microscopio electrónico de barrido EVO LS15 (Zeiss, Alemania) con un recubridor de pulverización iónica Q150RS (Quorum, Reino Unido) para examinar las alteraciones morfológicas de las muestras. Las muestras de antes y después de la fermentación y el residuo de muestra de cada etapa de digestión in vitro se secaron a 60 °C y se trituraron. Las muestras trituradas se fijaron en la plataforma de muestra SEM con adhesivo conductor y se recubrieron con oro en la superficie de la muestra usando un recubridor de pulverización iónica. Luego, las muestras se observaron a un voltaje de aceleración de 10 kv (aumento de 2000 ×).

El sobrenadante preparado anteriormente se concentró hasta sequedad en un dispositivo evaporador rotatorio RE-52AA (Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory, Shanghai, China) al vacío a 55 °C. El extracto seco se disolvió en etanol anhidro para preparar una solución de muestra de diferentes concentraciones para la determinación de la actividad antioxidante.

La actividad antioxidante se realizó a través de la actividad eliminadora de radicales libres 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). La actividad antioxidante se determinó según el método de Amarowicz, et al.19 y Chen, et al.20, con alguna modificación. Se mezclaron 100 µl de una solución de muestra de mg/ml con 1 ml de solución de etanol DPPH de 0,08 mg/ml. Luego, se añadió etanol anhidro hasta 4 ml. La mezcla se agitó vigorosamente y se incubó en oscuridad durante 30 min. La absorbancia de la solución se midió a 517 nm utilizando un espectrofotómetro UV-Visible TU-1810 APC. Se utilizó Vc como compuesto de referencia. Todas las pruebas se realizaron por triplicado. La actividad eliminadora de radicales libres se calcula según la siguiente ecuación:

donde AB es la absorbancia del control (DPPH sin muestra), AA es la absorbancia de la mezcla de reacción.

La actividad antioxidante se realizó a través de la actividad eliminadora del catión de sal diamina del radical bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) de 2,2-hidrazina (ABTS+). La actividad antioxidante se determinó según el método de Ali et al.21, con alguna modificación. Se agregaron cuatro mililitros de solución ABTS a 0,1 ml de diversas concentraciones de la solución de muestra. La mezcla se agitó vigorosamente y se incubó en oscuridad durante 6 min. La absorbancia de la solución se midió a 734 nm utilizando un espectrofotómetro UV-Visible TU-1810 APC. Se utilizó Vc como compuesto de referencia. La actividad eliminadora de radicales libres se calcula según la siguiente ecuación:

donde AB es la absorbancia del control (ABTS sin muestra), AA es la absorbancia de la mezcla de reacción.

Las estadísticas se realizaron utilizando el software SPSS 26. Todos los datos se presentaron como media ± error estándar (SE) de tres experimentos paralelos independientes. Las diferencias significativas entre las medias de las muestras fueron analizadas mediante la prueba de Duncan con un nivel de confianza del 95%14. Se utilizó el software Origin 2018 para graficar los resultados.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del primer autor, Cai-Yun Chen, previa solicitud razonable.

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Esta investigación fue apoyada financieramente por el Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82174039), el Proyecto general de la Fundación de Ciencias Naturales de Shandong (ZR2020MH371), el Proyecto de jóvenes expertos de Shandong Taishan Scholars (tsqn202103110), el Equipo joven y creativo para la introducción de talentos de la provincia de Shandong. (10073004), Grandes proyectos de innovación científica y tecnológica en la provincia de Shandong (2021CXGC010511), Proyecto de planificación de la medicina tradicional china de la provincia de Shandong (2021M139), Proyecto de planificación de las ciencias sociales de Binzhou (23-SKGH-002). Proyecto educativo Ministerio de Educación Industria-Universidad-Investigación (220500524270338).

Estos autores contribuyeron igualmente: Cai-Yun Chen y Run Zhang.

Escuela de Gestión y Salud Pública, Universidad Médica de Binzhou, Yantai, República Popular China

Cai-Yun Chen, Li-Jie Zhang, Zhi-Yong Hu, Xue Mei y Wei Mi

Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad Médica de Binzhou, Yantai, 264003, República Popular China

Run Zhang, Shao-Ping Wang y Jia-Yu Zhang

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RZ y CC escribieron el borrador y la metodología originales. ZH y SW escribieron revisión y edición. XM y LZ ayudaron a calcular y analizar datos. Supervisión de JZ y WM y adquisición de financiación. Todos los autores revisaron el manuscrito y aceptaron la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Wei Mi o Jia-Yu Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Chen, CY., Zhang, R., Zhang, LJ. et al. Biotransformación y bioaccesibilidad de ingredientes activos de Radix Astragali por Poria cocos durante la fermentación en estado sólido y digestión in vitro y evaluación de la actividad antioxidante. Representante científico 13, 6888 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33969-4

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Recibido: 27 de febrero de 2023

Aceptado: 21 de abril de 2023

Publicado: 27 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33969-4

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