Eliminación instantánea de biopelículas (iCBiofilm): un enfoque óptico para revisar las imágenes de biopelículas bacterianas y fúngicas

May 19, 2024

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 38 (2023) Citar este artículo

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La obtención de imágenes de biopelículas completas con resolución unicelular es necesaria para el análisis de la heterogeneidad celular a nivel de sistema, la identificación de funciones clave de los componentes de la matriz y la respuesta a las células inmunes y los antimicrobianos. Con este fin, desarrollamos un método de obtención de imágenes y eliminación de biopelículas completas, denominado eliminación instantánea de biopelículas (iCBiofilm). iCBiofilm es un método simple, rápido y eficiente que implica la inmersión de muestras de biopelículas en un medio con índice de refracción coincidente, lo que permite obtener imágenes instantáneas de toda la biopelícula con microscopía de barrido láser confocal. También desarrollamos iCBiofilm sin fijación, que permite obtener imágenes en vivo y dinámicas del desarrollo de biopelículas y las acciones de los antimicrobianos. iCBiofilm es aplicable para la obtención de imágenes multicolores de proteínas fluorescentes, componentes de matriz inmunoteñidos y células marcadas con fluorescencia en biopelículas con un espesor de varios cientos de micrómetros. iCBiofilm es escalable desde biopelículas bacterianas a fúngicas y puede usarse para observar las interacciones entre biopelículas y neutrófilos. Por lo tanto, iCBiofilm representa un avance importante para examinar la dinámica y funciones de las biopelículas y revisar la formación de biopelículas bacterianas y fúngicas.

Las biopelículas bacterianas son comunidades bacterianas altamente organizadas formadas en superficies bióticas o abióticas y en interfaces aire-líquido. Las biopelículas bacterianas en las superficies de los implantes médicos y los tejidos corporales pueden ser resistentes a los agentes antimicrobianos y a los sistemas de defensa del huésped, incluidos los fagocitos, los complementos y los péptidos antimicrobianos. Este fenómeno causa diversas enfermedades infecciosas humanas crónicas, como infecciones del torrente sanguíneo relacionadas con catéteres, infecciones del tracto urinario y endocarditis1,2,3. Por lo tanto, la formación de biopelículas en entornos clínicos da como resultado una mayor morbilidad y mortalidad, lo que impone una carga financiera significativa al sistema de salud. Además, las biopelículas pueden causar problemas logísticos en operaciones técnicas, como las que se encuentran en el mantenimiento de los sistemas de distribución de agua potable4. Sin embargo, las biopelículas también poseen características beneficiosas para la industria humana, como las que se aprovechan en la producción de alimentos fermentados, los procesos de bioconversión de compuestos orgánicos y el tratamiento de aguas residuales5. Por tanto, el desarrollo de estrategias innovadoras para el control y análisis de la formación de biopelículas es importante para diversos campos.

Se cree que las células bacterianas en las biopelículas están encerradas en una matriz típicamente autoproducida que comprende sustancias poliméricas extracelulares (EPS) como proteínas, polisacáridos y/o ADN extracelular6. El EPS desempeña diversas funciones en la formación y el mantenimiento de estructuras de biopelículas mediante la estimulación de la cohesión microbio-microbio y la adhesión microbio-superficie6. Sin embargo, las distribuciones tridimensionales de los componentes de la matriz de biopelículas y las propiedades heterogéneas de las células bacterianas incrustadas no se comprenden completamente. Además, la heterogeneidad o diferenciación celular en las biopelículas es un concepto comúnmente aceptado, pero ha sido difícil obtener evidencia directa a escala microscópica en el caso de biopelículas gruesas.

Por lo tanto, el desarrollo de estrategias que permitan una visualización rápida y eficiente de biopelículas es necesario para comprender mejor sus estructuras y funciones, incluidas las interacciones con otros microbios y el huésped y las respuestas a los antimicrobianos. Mientras que la microscopía óptica (MO), como la microscopía de barrido láser confocal (CLSM) y la microscopía de lámina luminosa combinadas con sondas de fluorescencia, permitieron a los investigadores estudiar la arquitectura tridimensional de las biopelículas y hacer una contribución sustancial a la comprensión actual de las biopelículas7,8,9 ,10, la obtención de imágenes de biopelículas gruesas a nivel unicelular sigue siendo un desafío, ya que la penetración de la luz en regiones más profundas es limitada cuando se utilizan técnicas de OM convencionales. Además, el CLSM estándar que utiliza una lente de inmersión en agua permitió obtener imágenes en vivo con resolución unicelular de una biopelícula de Vibrio cólera11,12. Este método puede ser aplicable a la obtención de imágenes de otras biopelículas bacterianas.

La limpieza de tejidos es un proceso que elimina biomacromoléculas (principalmente lípidos) que provocan la refracción y dispersión de la luz, ajustando así el índice de refracción (RI) de los tejidos en un disolvente circundante. En el campo de la neurociencia, las imágenes tridimensionales basadas en la limpieza de tejidos son la estrategia más práctica para visualizar células individuales dentro de muestras biológicas opacas, incluidos órganos completos y cuerpos de animales13. El principio básico de la limpieza de tejidos humanos mediante disolventes orgánicos se introdujo hace casi 100 años14. Desde entonces se han desarrollado varios métodos de limpieza de tejidos, incluidos (i) métodos basados ​​en disolventes orgánicos, como BABB15, 3DISCO16 e iDISCO;17 (ii) métodos basados ​​en productos químicos hidrófilos como SeeDB18, CUBIC19 y Scale;20 y ( iii) métodos a base de hidrogel, incluidos CLARITY21, PACT22 y SWITCH23. Aunque en los últimos 10 años se han puesto a disposición varios métodos de limpieza de tejidos, hasta donde sabemos, todavía no se han aplicado al análisis de la estructura, función y fisiología de las biopelículas. Además, las imágenes de células vivas basadas en la limpieza de tejidos siguen siendo un desafío porque los métodos de limpieza típicos requieren la fijación de muestras y procedimientos de limpieza y decoloración que requieren mucho tiempo, y que tardan varios días o más de una semana en realizarse.

En este estudio, desarrollamos un método de "limpieza instantánea de biopelículas (iCBiofilm)" utilizando medios compatibles con RI para examinar biopelículas gruesas formadas por bacterias grampositivas y negativas, así como la Candida albicans eucariota con una resolución unicelular. iCBiofilm permite obtener imágenes dinámicas y en vivo del desarrollo de biopelículas y la actividad de los agentes antimicrobianos. Utilizando este método, demostramos distribuciones heterogéneas de los componentes de la matriz de biopelículas en biopelículas de S. aureus y proponemos un mecanismo subyacente sobre cómo se determinan las distribuciones espaciales de las proteínas de la matriz de biopelículas. iCBiofilm también es útil para obtener imágenes de las interacciones entre biopelículas y neutrófilos.

De los diversos reactivos de limpieza de tejidos desarrollados recientemente, consideramos que SeeDB2 es el más adecuado para visualizar biopelículas gruesas con una resolución unicelular porque es un producto simple basado en remojo y que preserva la morfología que involucra altas concentraciones de iohexol24. Por lo tanto, como experimento preliminar, seleccionamos SeeDB2 para obtener imágenes de una biopelícula gruesa formada por el microorganismo modelo Staphylococcus aureus. A lo largo de este estudio, utilizamos principalmente S. aureus MR23, una cepa clínicamente aislada y resistente a la meticilina que forma una biopelícula espesa en un medio de infusión cerebro-corazón suplementado con 1% de glucosa (BHIG)9,25,26. Utilizamos microscopios invertidos para visualizar las estructuras tridimensionales de las biopelículas formadas en la superficie de platos con fondo de vidrio de 35 mm.

La biopelícula madura de MR23 era opaca en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pero transparente después del tratamiento con SeeDB2 (Fig. 1a). El CLSM invertido reveló que, cuando se sumergieron en PBS, solo las células ubicadas cerca del fondo de la biopelícula, dentro de 10 μm de la superficie del vidrio, eran visibles debido a la alta dispersión de la luz y las aberraciones esféricas (Fig. 1b). Cabe señalar que se observó una transición suave en la dirección z, lo que indica la presencia de células bacterianas, pero no la ausencia de células, por encima de la región visible. Por el contrario, cuando las biopelículas se trataron con SeeDB2 y se tiñeron con tioflavina T (ThT), que tiñe el ARN27 bacteriano, la región superior se volvió visible hasta cierto punto, con un espesor visible de aproximadamente 40 μm (Fig. 1b). Sin embargo, notamos que la capacidad de eliminación de SeeDB2 no era suficiente y que el reemplazo repetido de reactivos eliminó algunas células de la biopelícula. Además, se sospechaba que la saponina (el detergente incluido en SeeDB2) destruía la estructura de la biopelícula, ya que los detergentes en general pueden afectar la estructura de la biopelícula. Por lo tanto, nuestro objetivo fue desarrollar un método de limpieza óptica optimizado para biopelículas utilizando un reactivo sin detergente.

a Se obtuvieron fotografías de biopelículas MR23 en un papel impreso con un patrón de cuadrícula como fondo utilizando ImageQuant para la transmisión. En los paneles inferiores también se muestran los perfiles de las parcelas para las biopelículas tratadas con los reactivos de limpieza de tejidos indicados. La biopelícula tratada con solución salina tamponada con fosfato (PBS) se utilizó como control. La línea verde en la imagen superior indica la ubicación correspondiente del perfil de la parcela en el panel inferior, respectivamente. b Vistas laterales típicas de las biopelículas MR23 teñidas con tioflavina T (ThT). Se utilizó un microscopio de barrido láser confocal LSM880 con una lente objetivo de inmersión en aceite de × 40 y una unidad de superresolución Airyscan (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) para adquirir pilas z de biopelículas teñidas cada 0,22 μm. c Densidad óptica versus concentración de iohexol para biopelículas MR23. Se muestran las medias y las desviaciones estándar de tres mediciones. d Vistas laterales típicas de biopelículas MR23 fijas teñidas con FM1-43 y empapadas en las soluciones de iohexol indicadas. Se utilizó un microscopio de barrido láser confocal LSM880 con lente objetivo ×63 y unidad de superresolución Airyscan para adquirir pilas z de biopelículas teñidas cada 0,18 μm. X y Z representan ancho y espesor, respectivamente.

Durante el procedimiento de limpieza de la biopelícula usando SeeDB2, notamos que la transparencia de la biopelícula de S. aureus cambió de opaca a transparente en el paso de limpieza usando las Soluciones de limpieza 1 y 2, luego volvió a ser ligeramente opaca en los pasos usando las Soluciones de limpieza 3 y 4. Esta observación sugirió que los RI de la solución limpiadora 3 (RI = 1,46) y 4 (RI = 1,52) eran mayores que los de la biopelícula de S. aureus. De acuerdo con esto, el RI de muchas bacterias es aproximadamente 1,38-1,4228. Por lo tanto, optimizamos la concentración de iohexol para la biopelícula de S. aureus reduciendo su concentración. Con este fin, desarrollamos un método de detección de alto rendimiento utilizando placas de plástico de 96 pocillos y un microfotómetro para medir las densidades ópticas de biopelículas de S. aureus no fijadas empapadas en varias concentraciones de iohexol. La densidad óptica de la biopelícula cambió de manera dependiente de la concentración de iohexol (Fig. 1c). Además, la fijación con glutaraldehído (GA) al 1% afectó las características químicas de la biopelícula, aumentando la concentración de iohexol requerida para una transparencia óptima (Figura complementaria 1a). Es importante destacar que las altas concentraciones de iohexol dispersaron la biopelícula, lo que resultó en una disminución de la biomasa, mientras que la fijación con GA la estabilizó (Figura complementaria 1b). Por lo tanto, las biopelículas en experimentos posteriores se fijaron antes de remojarlas en iohexol. Después de este procedimiento, la densidad óptica más baja de la biopelícula fijada con GA se logró con 30 a 50% (p/p) de iohexol (Figura complementaria 1a). Las imágenes CLSM de una biopelícula de S. aureus teñida con el tinte de membrana FM1-43 también revelaron que las biopelículas con> 60 μm de espesor se visualizaron claramente en iohexol al 35,2% (p/p) (Fig. 1d). De manera similar, se observó claramente una biopelícula teñida con ThT en todos los espesores con resolución unicelular (Película complementaria 1). En particular, la biopelícula opaca se volvió transparente inmediatamente después de agregar 35,2 % (p/p) de iohexol solo (Película complementaria 2), lo que indica que el medio compatible con RI fue suficiente para otorgar transparencia a la biopelícula de S. aureus sin eliminar algunas biomoléculas. Este método simple y eficiente para visualizar biopelículas gruesas utilizando solo un reactivo compatible con RI sin detergente se denominó iCBiofilm. Es de destacar que el reactivo de compatibilidad con RI no se limita a iohexol (Figuras complementarias 2 y 3). Diatrizoato, yodixanol, iopromida, iopamidol e ioversol mostraron una alta capacidad de eliminación (Figura complementaria 2a). Estos reactivos mejoraron las imágenes de la biopelícula gruesa en comparación con el PBS (Figura complementaria 2b). Anteriormente, se utilizó una lente de inmersión en agua para analizar la dinámica de una biopelícula viva de V. cholera11,12, pero no pudimos observar ninguna diferencia en el espesor visible entre las lentes de inmersión en aceite y en agua, al menos en el caso de la lente S sumergida en PBS. aureus biopelícula (Figura complementaria 2b). Por lo tanto, creemos que la coincidencia de RI entre las biopelículas y la solución circundante es más importante para obtener imágenes de biopelículas completas que la elección de una lente objetiva. Como se menciona a continuación, el reactivo compatible con RI se puede cambiar con fines experimentales.

A continuación, comparamos iCBiofilm con otros métodos de limpieza de tejidos disponibles, incluidos CUBIC19, ScaleS29 y SeeDB224, para la limpieza y la obtención de imágenes de la biopelícula MR23. La capacidad de eliminación de biopelículas de iCBiofilm fue superior a la de los demás (Fig. 1a). iCBiofilm mejoró enormemente la obtención de imágenes de la biopelícula MR23 con un espesor de ~80 μm, mientras que los otros métodos fueron insuficientes para obtener imágenes de la biopelícula completa (Fig. 1b). Aunque CUBIC, ScaleS y SeeDB2 requirieron varios días o semanas para eliminar las biopelículas y tejidos, iCBiofilm solo tardó unos segundos para eliminar las biopelículas (Película complementaria 2). iCBiofilm conservó la estructura de la biopelícula fijada, mientras que SeeDB2 la dañó probablemente debido al reemplazo repetido de reactivos de limpieza viscosos complementados con detergentes. Además, el manejo de iCBiofilm fue muy sencillo, mientras que CUBIC, ScaleS y SeeD2 fueron fáciles pero contenían reactivos viscosos, lo que dificultó ligeramente el manejo. En conjunto, iCBiofilm fue el método más rápido, simple, efectivo y no invasivo para obtener imágenes de biopelículas completas (Tabla 1).

Se cree que la formación de biopelículas bacterianas comienza con el contacto inicial de una célula bacteriana individual con una superficie, seguido de la proliferación y formación de una microcolonia, la producción de matrices extracelulares que incrustan células bacterianas y el establecimiento de una estructura tridimensional compleja para formar una biopelícula madura5. Para confirmar si esta teoría ampliamente aceptada podría observarse utilizando nuestro método, realizamos imágenes de células vivas para el desarrollo de biopelículas utilizando iCBiofilm. Primero, examinamos la citotoxicidad del iohexol contra S. aureus. Iohexol redujo la turbidez del cultivo líquido pero no afectó la viabilidad de S. aureus (Figuras complementarias 4a, b).

A continuación, examinamos los efectos del iohexol en la estructura de la biopelícula de S. aureus MR23. Cuando se cultivó en BHIG, se formó una biopelícula robusta de MR23, firmemente adherida a la superficie del vidrio (Figura complementaria 5). Sin embargo, cuando se cultivó en BHIG suplementado con 28,1% (p/p) de iohexol, se observó una biopelícula frágil y flotante (Figura complementaria 5). Esto indicó que el 28,1% (p/p) de iohexol interfirió con la interacción de la biopelícula con la superficie del vidrio, afectando así gravemente la adhesión y la estructura. Por lo tanto, buscamos medios compatibles con RI óptimos para la obtención de imágenes de células vivas de biopelículas frágiles utilizando S. aureus MR4 como cepa indicadora con una biopelícula más frágil que la de S. aureus MR23. Todos los compuestos probados lograron la eliminación de la biopelícula en un grado similar (Fig. 2a), pero solo el iodixanol no mostró un efecto notablemente destructivo sobre la biopelícula MR4 preformada (Fig. 2b), lo que sugiere que el iodixanol se puede usar para varios tipos de biopelículas. Es importante destacar que este compuesto no afectó la viabilidad, la tasa de crecimiento y la forma celular de S. aureus (Figuras complementarias 4b-d). Además, el iodixanol pudo eliminar la biopelícula de S. epidermidis SE21, un aislado clínico que forma una biopelícula dependiente de polisacáridos (Fig. 2c) y no causó dispersión en la biopelícula preformada (Fig. 2d). La tasa de crecimiento de S. epidermidis SE21 tampoco se vio afectada por el iodixanol (Fig. 2e). Por lo tanto, seleccionamos iodixanol para obtener imágenes de células vivas del desarrollo de biopelículas.

a Densidad óptica frente a concentración de los medios de coincidencia de índice de refracción indicados para la biopelícula de S. aureus MR4 no fijada. b Efectos de los reactivos aclaradores sobre la estabilidad de la biopelícula MR4 no fijada. c Densidad óptica versus concentración de iodixanol para biopelícula de S. epidermidis SE21 no fijada. d Efectos del iodixanol sobre la estabilidad de la biopelícula SE21 no fijada. e Gráficos de violín de los tiempos de duplicación de las células SE21 medidos mediante microscopía óptica a nivel de una sola célula. Las células se cultivaron en placas de agar BHI en ausencia (BHI, n = 403) y presencia de iodixanol al 30,0% (p/v) (BHI+, n = 283) bajo el microscopio de contraste de fases. ns, no significativo (prueba t de Student de dos colas no apareada). f Imágenes de limpieza de células vivas para la formación de biopelículas de S. epidermidis SE21 en BHIG que contiene 30,0% (p/v) de iodixanol y ThT 25 μM en una placa con fondo de vidrio. Se muestran imágenes en 3D en los puntos de tiempo indicados. Las flechas indican grupos de células formadas en la fase inicial de formación de biopelículas. Las medias y las desviaciones estándar de cuatro mediciones se muestran en a–d.

Para realizar imágenes de células vivas de manera estable a lo largo del tiempo utilizando el microscopio confocal ZEISS LSM880, se incubaron biopelículas durante 2 a 4 h en una cámara de incubación en una microspora confocal equipada con un módulo de enfoque automático. En primer lugar, se utilizó ThT para teñir células SE21 de S. epidermidis porque no inhibe el crecimiento en una concentración optimizada27. Las células individuales y las microcolonias teñidas con ThT se observaron fácilmente al inicio de las imágenes (Fig. 2f y Película complementaria 3). Inesperadamente, con el tiempo se observó proliferación de células además de microcolonias, en lugar de expansión de microcolonias (Fig. 2f y Película complementaria 3). Este no fue un efecto secundario de ThT, ya que la microscopía de reflexión confocal de una biopelícula de S. epidermidis no teñida mostró una tendencia similar (Película complementaria 4). Para ampliar la aplicabilidad de las imágenes de células vivas basadas en iCBiofilm, también utilizamos MitoTracker Deep Red y el sistema de imágenes THUNDER desarrollado por Leica Microsystems para realizar imágenes rápidas de células vivas en 3D. Los tintes fluorescentes MitoTracker se utilizan a menudo para teñir mitocondrias en células eucariotas dependiendo de su potencial de membrana y pueden teñir bacterias vivas sin afectar la tasa de crecimiento30. Debido a la rápida velocidad de obtención de imágenes, el sistema de imágenes THUNDER nos permitió ver la acumulación de células planctónicas en la superficie del vidrio y en la biopelícula preexistente (Película complementaria 5). Como en el caso de las imágenes LSM880, con el tiempo se observó predominantemente la proliferación de células adyacentes a las microcolonias, en lugar de la expansión de las microcolonias preexistentes (Película complementaria 5).

También se realizaron imágenes de células vivas utilizando iCBiofilm para analizar la formación de biopelículas por S. aureus MR23. Curiosamente, se observó la expansión de microcolonias acompañada por la acumulación de células planctónicas y agregadas sobre la biopelícula (Fig. 6 complementaria y Película complementaria 6), lo que era inconsistente con el proceso de formación de biopelícula de S. epidermidis SE21 descrito anteriormente (Fig. 2f y Películas complementarias 3 a 5). Se observó una ligera disminución de la fluorescencia, probablemente debido a una reducción del potencial de membrana a medida que disminuía la actividad metabólica dentro de la biopelícula31. Además, la formación de biopelículas por S. aureus MR4 se visualizó mediante imágenes de células vivas basadas en iCBiofilm (Película complementaria 7), y el proceso fue distinto del de SE21 o MR23 (Películas complementarias 5 y 6). Específicamente, se observaron células altamente dinámicas y móviles durante la formación de biopelículas mediante MR4 (Película complementaria 7). Estos resultados indican que el proceso de desarrollo de biopelículas difiere entre especies y cepas bacterianas. Por lo tanto, las imágenes de células vivas utilizando iCBiofilm son útiles para analizar la formación de biopelículas en varios tipos de biopelículas.

Dados nuestros hallazgos que indican que iCBiofilm puede lograr imágenes de células vivas, nuestro objetivo fue observar los efectos de los antimicrobianos en una biopelícula viva. Se utilizaron Syto 9 y yoduro de propidio (PI) para distinguir entre células vivas y muertas (dañadas en la membrana). Ambos son colorantes de ácidos nucleicos, pero Syto 9 permeabiliza tanto las células vivas como las muertas, mientras que el PI solo permeabiliza las células dañadas por la membrana (muertas)32. Este método permitió la visualización estable de células vivas y muertas dentro de la biopelícula durante al menos 1 h (Figura complementaria 7 y Película complementaria 8). En primer lugar, tratamos la biopelícula con vancomicina, que es eficaz contra las células planctónicas de S. aureus pero no contra su biopelícula32. Como se esperaba, la vancomicina no fue eficaz para matar las células de S. aureus dentro de la biopelícula (Figura complementaria 7 y Película complementaria 9). A continuación, se utilizó la nisina A aislada de Lactococcus lactis porque se considera eficaz para matar biopelículas preformadas de varias cepas de S. aureus32. Después de agregar nisina A, la proporción de células muertas aumentó rápidamente, pero no todas las células murieron (Figura complementaria 7 y Película complementaria 10). Esto fue consistente con datos anteriores del recuento de UFC, que mostraron que solo el 90% de las células en la biopelícula de S. aureus MR23 fueron eliminadas por la nisina A32. Curiosamente, las células en las regiones convexas de la biopelícula mostraron tolerancia contra la nisina A en comparación con las de las regiones cóncavas (Figura complementaria 7 y Película complementaria 10), posiblemente debido a la distribución heterogénea de células susceptibles y tolerantes y a la existencia de componentes de la matriz. interfiriendo con la acción de la nisina A en las regiones convexas.

En conjunto, estos resultados indican que iCBiofilm es aplicable para la obtención de imágenes de los efectos antimicrobianos en biopelículas y podría ser útil para establecer soluciones médicas para la erradicación de biopelículas.

Para probar si iCBiofilm podría aplicarse a la visualización de los componentes de la matriz de S. aureus, primero intentamos visualizar proteínas secretadas y ancladas a la pared celular, como la proteína de adherencia extracelular (Eap) y la proteína G de superficie de Staphylococcus aureus (SasG). Utilizamos el anticuerpo anti-Eap y la cepa doble knockout spa sbi de MR23 (MR23 Δspa Δsbi) porque la proteína estafilocócica A (Spa) y la segunda proteína de unión a inmunoglobulina (Sbi) inhiben la inmunodetección específica de las proteínas diana (Figura complementaria 8a) a través de interacción con inmunoglobulina G (IgG). MR23 Δspa Δsbi forma una biopelícula robusta equivalente a la de la cepa de tipo salvaje33 y los anticuerpos llegaron al fondo de la biopelícula y revelaron con éxito la localización de Eap en toda la estructura de la biopelícula (Fig. 3a y Película complementaria 11). Una cantidad considerable de Eap se localizó en la capa inferior de la biopelícula y se adhirió a la superficie del sustrato. Por el contrario, los experimentos de control no mostraron fluorescencia en ausencia de anticuerpo primario anti-Eap (Figura complementaria 8b), ni cuando se usó MR23 Δspa Δsbi Δeap en lugar de MR23 Δspa Δsbi (Figura complementaria 8c), lo que indica que Eap se detectó específicamente por el anticuerpo. Además, rara vez se detectó Eap en la región superior de la biopelícula (Fig. 3a), lo que sugiere que Eap desempeña un papel clave en las interacciones entre célula y sustrato, en lugar de funcionar como un refugio en la superficie de la biopelícula. Una vista de cerca indicó que Eap se detectó como puntos o fibras cortas en las interfaces entre las células de S. aureus (Fig. 3b), lo que sugiere que Eap desempeña un papel en las interacciones entre células como pegamento molecular. Estos resultados son consistentes con observaciones previas de que Eap promueve la agregación celular25. Además, la distribución de Eap era distinta de la de la proteína SasG anclada a la pared celular, que también desempeña un papel importante en la formación de biopelículas gruesas de MR239. SasG se localiza en la superficie de solo una pequeña cantidad de células, formando una forma similar a un anillo. (Fig. 3c, d y Película complementaria 12). La distribución en forma de anillo de SasG se parecía a la de otras proteínas ancladas a la pared celular, como Spa34,35, el factor de agrupación A, la proteína B de unión a fibronectina y la proteína C36 que contiene repeticiones de serina-aspartato. Además, las células que expresan SasG formaron pequeños grupos (Fig. 3d y Película complementaria 12). De acuerdo con el mecanismo de anclaje de la pared celular de SasG, el SasG localizado en la superficie debe expresarse y secretarse por cada célula que lo exhiba en la superficie37.

Las vistas laterales típicas (a, c) y las secciones XY para las posiciones de pila z seleccionadas (b, d) de biopelículas MR23 Δspa Δsbi teñidas con anticuerpos y FM1-43. Las señales fluorescentes de Eap/SasG y las células (membrana) en la vista combinada se muestran en magenta y verde, respectivamente. e Vistas laterales de la biopelícula formada por MR23 Δspa Δsbi Peap::mScarlet-1. f Secciones XY para la pila z seleccionada que muestra la distribución de células que expresan Eap y Eap en la biopelícula. Las señales fluorescentes de mScarlet-I (células que expresan Eap), IgG anti-conejo conjugada con anti-Eap/Alexa 488 y ADN (células bacterianas totales) se muestran en magenta, amarillo y cian, respectivamente, en e, f. g Las secciones XY para la pila z seleccionada muestran la distribución de células que expresan Eap y/o SasG en la biopelícula de 24 h de MR23 Δspa Δsbi Peap::mScarlet-1 PsasG::mNeonGreen. Las señales fluorescentes de mScarlet-I (células que expresan Eap), mNeonGreen (células que expresan SasG) y ADN (células bacterianas totales) se muestran en magenta, amarillo y cian, respectivamente. Las barras de escala son de 5 μm. X y Z representan ancho y espesor, respectivamente. Todas las imágenes se tomaron después de remojar las biopelículas en una solución de iohexol al 35,2% (p/p). Se utilizó un microscopio LSM880 con lentes objetivos × 20, × 63 y × 100 y una unidad de superresolución Airyscan para adquirir pilas z de las biopelículas teñidas.

La siguiente pregunta que abordamos fue por qué Eap mostró patrones de distribución tan característicos en las biopelículas observadas. Un escenario posible era que la distribución espacial de las células que expresan Eap determinara la localización de la proteína. Para investigar esto, generamos MR23 Δspa Δsbi que expresa la fusión transcripcional eap::mScarlet-1 a partir del cromosoma y examinamos las células que expresan Eap usando iCBiofilm. Como se muestra en la Fig. 3e, las células que expresan Eap (mScarlet-1 positivas) se localizaron en la mitad inferior de la biopelícula. La Eap secretada se detectó en una región similar y en la superficie del sustrato, como se describe en los primeros experimentos de Eap anteriores. Rara vez se observaron células que expresan Eap y Eap secretada en la región superior de la biopelícula. Una vista de cerca reveló que las células que expresaban Eap se distribuían de manera heterogénea y formaban grupos en los que la Eap secretada se localizaba predominantemente en la interfaz entre las células (Fig. 3f). Además, el número de células que expresan SasG fue menor que el de las células que expresan Eap y las subpoblaciones de células que expresan Eap que coexpresan SasG (Fig. 3g).

Estos resultados indican que iCBiofilm se puede utilizar para obtener imágenes multicolores de proteínas de matriz y células bacterianas en biopelículas utilizando anticuerpos marcados con fluorescencia, proteínas fluorescentes y sondas de ácido nucleico.

A continuación, utilizamos iCBiofilm para observar polisacáridos extracelulares y ADNe en una biopelícula de S. aureus. Se utilizó aglutinina de germen de trigo conjugada con Alexa Fluor 647 (WGA-Alexa 647) para detectar polisacáridos extracelulares en una biopelícula de S. aureus porque se une fuertemente a las poli-N-acetilglucosaminas, un componente importante de los polisacáridos extracelulares estafilocócicos25,26. Además, se seleccionó S. aureus MR10, una cepa clínicamente aislada de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, porque produce una gran cantidad de polisacáridos y forma una biopelícula robusta dependiente de polisacáridos25,26. Como se muestra en la Fig. 4a, b, se formó una biopelícula MR10 con un espesor de 25 a 50 µm y una capa superficial de polisacáridos. Una imagen de gran aumento destacó redes de fibras de polisacáridos extracelulares que conectan células de S. aureus, lo que sugiere que funcionaban como adhesinas intercelulares (Fig. 4c).

a – c Imágenes de microscopía de barrido láser confocal (CLSM) de la biopelícula de S. aureus MR10 teñidas con WGA-Alexa 647 (PIA, magenta) y FM1-43 (células, verde). Imágenes d – f CLSM de la biopelícula S. aureus MR23 Δspa Δsbi teñida con anticuerpo monoclonal de ratón anti-dsDNA e IgG anti-ratón conjugada con Alexa 647 (eDNA, magenta) y FM1-43 (células, verde). La biopelícula se empapó en una solución de iohexol al 35,2% (p/p). Se muestran las vistas laterales típicas de las biopelículas (a, d), imágenes ortogonales (b, e) y las secciones XY para las posiciones de pila z seleccionadas (c, f) adquiridas con lentes objetivos de ×20 y ×63. Las barras de escala son de 50 μm en b, ey 10 μm en c, f.

Además, el ADNe se detectó utilizando el anticuerpo monoclonal anti-ADNds. Se utilizó la cepa MR23 Δspa Δsbi porque carece de proteínas de unión a IgG, que interfieren con la detección específica de proteínas mediante anticuerpos33. El ADNe se detectó principalmente en la región superior de la biopelícula (Fig. 4d, e). A diferencia de las estructuras fibrilares de los polisacáridos extracelulares (Fig. 4c), el ADNe se detectó como puntos y agregados en las superficies de las células bacterianas (Fig. 4f).

En conjunto, estos hallazgos indican que iCBiofilm es útil para obtener imágenes de la distribución heterogénea de múltiples componentes de la matriz de biopelículas en biopelículas gruesas de S. aureus y para analizar los mecanismos de cómo se determinan dichos patrones.

Se cree que las células bacterianas en una biopelícula están protegidas de los sistemas de defensa del huésped, como los neutrófilos y los péptidos antimicrobianos1. Nuestro objetivo era examinar esto utilizando iCBiofilm. Aquí, se usó ioversol en lugar de iohexol porque el iohexol tendía a dispersar biopelículas de S. aureus no fijadas (Figura 1 complementaria) y puede disociar la interacción entre biopelículas y neutrófilos. Como se muestra en las figuras 5a, b y 9a complementaria, los neutrófilos parecían flotar sobre la biopelícula, lo que puede sugerir falsamente la existencia de componentes de la matriz no visibles en la interfaz entre los neutrófilos visualizados y la biopelícula. Sin embargo, las imágenes de iCBiofilm demostraron claramente que los neutrófilos penetraron en la biopelícula gruesa (Fig. 5c, d, Fig. complementaria 9b) y fagocitaron las células de S. aureus (Fig. 5c y Fig. complementaria 9c), lo cual es inconsistente con la larga duración. Noción establecida de que las células incluidas en biopelículas están protegidas de la fagocitosis de neutrófilos por la matriz de biopelícula. Nuestros resultados implican el concepto de que algunas células de la biopelícula pueden funcionar como señuelos, atrapando a los neutrófilos lejos de las otras células de la biopelícula. Esta estrategia podría contribuir a la supervivencia de las células de biopelícula que se encuentran con células fagocíticas. Estas observaciones sugieren que iCBiofilm podría resultar útil para investigar las interacciones entre las biopelículas y las defensas inmunitarias del huésped.

Las biopelículas de S. aureus MR23 y los neutrófilos de ratones se tiñeron con FM1-43 (verde) y anti-Ly-6G conjugado con Alexa 647 (magenta), respectivamente. Los neutrófilos también se tiñeron con FM1-43, pero se pueden distinguir de las células bacterianas por su tamaño y forma. Las formas grandes de color magenta representan neutrófilos, mientras que las formas verdes representan células de biopelícula. Las muestras se empaparon en PBS (a, b) o ioversol al 37,1% (p/v) (c, d) y se observaron utilizando un microscopio LSM880 con un objetivo de ×63 y una unidad de superresolución Airyscan. a, c Imágenes ortogonales. Las barras de escala son de 10 μm. b,d imágenes en 3D.

Para ampliar la aplicabilidad de nuestro método para obtener imágenes de una biopelícula gramnegativa, utilizamos iCBiofilm para observar una biopelícula de Escherichia coli, con el objetivo de identificar proteínas Curli, fibras amiloides extracelulares producidas por dichas enterobacterias. Un estudio previo que utilizó fluorescencia y microscopía electrónica de barrido reveló la microanatomía y microfisiología de una biopelícula de macrocolonia de E. coli formada en placas de agar con una resolución celular sin precedentes38; sin embargo, se sabe poco sobre las biopelículas acuosas de E. coli. En este estudio, cultivamos E. coli BW25113 en YESCA a 25 °C durante 3 a 7 días, produciendo así proteínas Curli (Fig. 6a) dentro de una biopelícula robusta en la interfaz aire-líquido (Fig. 6b, c)39. 40. Como en el caso de las biopelículas de S. aureus, la biopelícula de E. coli era opaca y se volvió transparente después de remojarla en iohexol al 35,2% (p/p) (Fig. 6c). La microscopía de inmunofluorescencia indirecta utilizando un anticuerpo anti-Curli mostró la distribución de las proteínas Curli en toda la biopelícula acuosa (Fig. 6d, e). Una vista de cerca reveló la existencia de estructuras fibrilares teñidas con el anticuerpo anti-Curli y las células estaban encerradas en una red de fibras de Curli (Fig. 6f).

a Una imagen típica de microscopía electrónica de transmisión de E. coli BW25113 cultivada en placas de agar YESCA. La imagen muestra células bacterianas rodeadas de fibras amiloides de Curli (flecha negra). b Imagen de un cultivo líquido de YESCA inclinado para formar una biopelícula de E. coli en la interfaz aire-líquido. c Biopelículas de E. coli empapadas en PBS o iohexol al 35,2% (p/p). d Vistas laterales típicas de biopelículas de E. coli teñidas con IgG de conejo anti-Curli e IgG anti-conejo conjugada con Alexa 647 (Curli, magenta) y FM1-43 (células, verde). La biopelícula se empapó en una solución de iohexol al 35,2% (p/p) y se observó utilizando un microscopio LSM800 con lentes objetivos de ×63 y ×100 y una unidad de superresolución Airyscan. e Imágenes ortogonales. f Una sección XY típica para la posición de pila z seleccionada. Las barras de escala son 500 nm en a, 10 μm en e y 5 μm en f.

Un estudio anterior ha descubierto que las células Curli y las que expresan Curli se localizan en la región exterior de las microcolonias formadas en placas de agar, mientras que las zonas inferiores de estas biopelículas presentan células alargadas en división y una malla apretada de flagelos entrelazados41. Esta distribución heterogénea de Curli fue inconsistente con las observaciones presentadas en este estudio (Fig. 6d, e). Estos resultados indican que las características de las biopelículas de E. coli y la distribución de las fibras de Curli dependen de las condiciones de cultivo. Estas diferencias pueden explicar la distinta susceptibilidad de las biopelículas acuosas y las microcolonias de E. coli productora de Curli a agentes antibiopelículas como la catequina del té verde, la epigalocatequina-3-galato (EGCG)39,41 y el flavonoide de origen vegetal miricetina42,43. Por ejemplo, EGCG promovió la degradación de la ARN polimerasa sigma factor S (RpoS), uno de los principales reguladores de la biosíntesis de Curli, mediante la degradación por la proteasa dependiente de ATP ClpXP en biopelículas acuosas39, pero no afectó el nivel celular de RpoS en microcolonias41. .

Para probar la aplicabilidad de iCBiofilm a biopelículas fúngicas, elegimos Candida albicans como modelo de hongo patógeno importante que causa infecciones asociadas a biopelículas en humanos. Sin embargo, la obtención de imágenes tridimensionales de biopelículas completas de C. albicans con un espesor de más de 100 µm es convencionalmente un desafío44. Como se muestra en la Fig. 7a, solo se observó la región inferior de la biopelícula en el control de PBS, mientras que se observó toda la biopelícula usando 56,2% (p/p) de iohexol. Además, el 45,0% (p/v) de iodixanol también fue eficaz para visualizar la biopelícula de C. albicans (Fig. 7a), lo que indica que los medios compatibles con RI son suficientes para hacer que las biopelículas de C. albicans sean transparentes y permitan obtener imágenes profundas.

a Imágenes en 3D de biopelículas de C. albicans teñidas con FM1-43. Las biopelículas teñidas se empaparon en las soluciones indicadas y se observaron utilizando un microscopio LSM880 con un objetivo de ×20. b Vistas lateral e inferior de biopelículas de C. albicans teñidas con los tintes indicados. c Vistas lateral e inferior de biopelículas de C. albicans formadas en las condiciones empleadas en el modelo de Douglas45. d Vistas lateral e inferior de biopelículas de C. albicans cultivadas en condiciones similares en a y b, pero con un número inicial de células de C. albicans de 107 UFC/ml. Las biopelículas se tiñeron con Con A-Alexa 594, se empaparon en iodixanol al 45,0 % (p/v) y se observaron utilizando el microscopio LSM880.

A continuación, se comparó el iodixanol con reactivos de montaje disponibles comercialmente. El iodixanol fue superior a los otros medios para visualizar biopelículas de C. albicans de más de 500 μm de espesor (Figura complementaria 10a). Además, algunos medios de inmersión, como Super Clear Mount, Immersion M, ProLong Diamond y SlowFade Diamond, destruyeron parcialmente la biopelícula de C. albicans fijada con paraformaldehído (PFA) (Figura complementaria 10b) o la biopelícula de S. aureus (Figura complementaria Figura 10c). Con base en estos hallazgos, recomendamos 15,0-45,0 % (p/v) de iodixanol o 35,2-56,2 % (p/p) de iohexol para la obtención de imágenes de biopelículas de C. albicans y S. aureus.

Para teñir la biopelícula gruesa de C. albicans, la concanavalina A conjugada con Alexa Fluor 594 (Con A-Alexa 594) se consideró más apropiada que FM1-43 y Calcofluor White (Fig. 7b). Específicamente, no se recomienda el uso de Calcofluor White para futuros estudios, ya que solo nos permitió visualizar una región basal de la biopelícula debido a las cortas longitudes de onda de excitación y emisión.

Las vistas inferiores de la biopelícula revelaron muchas pseudohifas e hifas, pero solo una pequeña cantidad de células en forma de levadura (Fig. 7b), un resultado inconsistente con el modelo de Douglass. En este modelo, se propone que las células en forma de levadura se adhieran al sustrato y formen una policapa basal que funcione para anclar la biopelícula. A esto le sigue la aparición del tubo germinal de las células superiores en forma de levadura, el alargamiento de las hifas y el depósito de una matriz extracelular compuesta de proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos45. Esta discrepancia podría deberse a diferencias en las condiciones de cultivo. Por tanto, preparamos una biopelícula de C. albicans según el procedimiento del modelo de Douglas. Aunque se observó una mayor cantidad de células en forma de levadura en la parte inferior de la biopelícula en comparación con el procedimiento anterior, no formaron una policapa (Fig. 7c). Se observó un resultado similar cuando el número de células iniciales de C. albicans aumentó de 106 a 107 UFC/ml (Fig. 7d). Creemos que nuestro procedimiento iCBiofilm alivió considerablemente la limitación de la penetración del láser en biopelículas gruesas utilizando CLSM vertical convencional y mejoró la obtención de imágenes de biopelículas de C. albicans, especialmente en la región inferior de la estructura tridimensional.

Además, la formación de biopelículas por C. albicans se visualizó mediante imágenes de células vivas utilizando iCBiofilm y el sistema de imágenes THUNDER, ya que el iodixanol no afectó el crecimiento celular (tasa de alargamiento de las hifas) ni la forma de C. albicans (Fig. 8a-c). En las 3 h iniciales, se observó una capa basal de biopelícula con un espesor de aproximadamente 20 μm y muchas células planctónicas en caída (Fig. 8d y Película complementaria 13). Posteriormente, la germinación y el alargamiento de las hifas se visualizaron claramente 4 h después del inicio (Fig. 8d y Película complementaria 13). El alargamiento de las hifas continuó con el tiempo y, después de 24 h, el espesor de la biopelícula alcanzó aproximadamente 200 μm (Película complementaria 13). El análisis unicelular de las células de C. albicans que tienen una capa basal demostró nuevamente que muchas células en forma de levadura se adhieren a la superficie del vidrio, seguidas de la germinación y el alargamiento de las hifas varias horas después de la inoculación (Figura complementaria 11a). Las tasas de alargamiento de las hifas verdaderas y las pseudohifas fueron similares (Figura complementaria 11b, c).

a Se observó mediante microscopía de contraste de fases el crecimiento de células SC5314 de C. albicans en placas de agar RPMI en ausencia (RPMI) y presencia de iodixanol al 30,0 % (p/v) (RPMI+). Las puntas de flecha coloreadas indican hifas alargadas individuales. b Gráficos de violín de las velocidades de alargamiento de las hifas analizadas mediante imágenes microscópicas tomadas cada 1 minuto. RPMI, n = 235. RPMI+, n = 185. ns, no significativo (prueba t de Student de dos colas no apareada). c Imágenes ASEM de células SC5314 cultivadas en cultivos líquidos RPMI y RPMI +. d La biopelícula de SC5314 se formó en RPMI-MOPS (pH 7,0) que contenía 24% (p/v) de iodixanol y MitoTracker Deep Red 1 μM en un plato con fondo de vidrio. Las imágenes 3D en los puntos temporales indicados se muestran en una escala de colores de mapa de calor que representa el espesor de la biopelícula. Las escalas son de 10 μm en a, c.

Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que visualiza el desarrollo de una biopelícula viva con un espesor de> 100 μm con una resolución unicelular.

Este estudio tuvo como objetivo desarrollar un método de limpieza óptica para investigar biopelículas. El método resultante, iCBiofilm, se muestra prometedor como herramienta para obtener imágenes profundas de diversas biopelículas microbianas in vitro. En comparación con los métodos convencionales de limpieza de tejidos (CUBIC, ScaleS y SeeDB2), iCBiofilm es un método rápido, simple, rentable y no invasivo, ya que solo requiere remojar las biopelículas en medios compatibles con RI (Fig. 1 y Tabla 1). iCBiofilm permite obtener imágenes de células vivas de varias biopelículas microbianas (S. aureus, S. epidermidis y C. albicans), una hazaña que antes se consideraba difícil mediante la limpieza de tejido convencional.

Los procedimientos de iCBiofilm finalmente adaptados se describen en la Fig. 12 complementaria y en la subsección de "Eliminación de biopelículas fijadas con iCBiofilm" en Métodos. Para obtener imágenes de biopelículas de células vivas, se recomienda agregar iodixanol en un caldo de cultivo adecuado al 15-30% (p/v). Se pueden obtener imágenes de la formación de biopelículas de bacterias y hongos que expresan constitutivamente proteínas fluorescentes con el tiempo sin teñir ninguna sonda fluorescente. Alternativamente, se pueden utilizar reactivos ThT y Mitotracker para obtener imágenes de células vivas. Para obtener imágenes de biopelículas en 3D, las biopelículas deben fijarse con 4% de PFA o 1% de GA y 4% de PFA y luego filtrarse con una o más sondas fluorescentes adecuadas. La elección de los reactivos fijadores y las sondas fluorescentes depende de las propiedades de las biopelículas interesadas y de los fines experimentales. Las biopelículas opacas se pueden eliminar inmediatamente agregando uno de los regentes de iCBiofilm y obtener imágenes mediante CLSM u otras microscopías ópticas. Como primera opción, se recomienda el uso de 45% (p/v) de iodixanol para eliminar biopelículas frágiles, mientras que se recomienda 35,2% (p/v) de iohexol para biopelículas estables. Como se muestra en la figura complementaria 2, el iohexol se puede reemplazar con otros medios compatibles con RI, incluidos iodixanol, ioversol, iopamidol e iopromida, pero el iohexol es capaz de eliminarse más rápidamente en comparación con los demás. No se recomienda el diatrizoato para la limpieza de biopelículas, ya que decoloró la biopelícula de S. aureus teñida. Si la limpieza no es suficiente, se recomienda optimizar la concentración de los medios compatibles con RI para biopelículas individuales.

Nuestro enfoque, sin embargo, muestra algunas limitaciones. Las concentraciones de iodixanol utilizadas para la obtención de imágenes de células vivas en este estudio fueron ligeramente inferiores a la concentración óptima para la eliminación de biopelículas, ya que concentraciones más altas inhibieron la formación de biopelículas de los microorganismos probados en la superficie del vidrio. Por lo tanto, para lograr la más alta calidad de imagen y las condiciones óptimas para la formación de biopelículas de diversos microorganismos, en el futuro se deben desarrollar medios alternativos que coincidan con RI. Dado que el iodixanol de baja viscosidad fue superior al iohexol de alta viscosidad para la obtención de imágenes de células vivas del desarrollo de biopelículas, creemos que la viscosidad de los medios compatibles con RI es un punto clave para detectar medios alternativos compatibles con RI.

El método iCBiofilm también resultó útil para obtener imágenes de las interacciones entre las biopelículas y los sistemas de defensa del huésped. Pudimos analizar la fagocitosis de células de biopelícula por parte de neutrófilos. Sin embargo, fijamos las muestras utilizando PFA; por lo tanto, las imágenes obtenidas fueron instantáneas de fagocitosis. La obtención de imágenes de células vivas de la fagocitosis de biopelículas por neutrófilos es de gran interés, pero sigue siendo un desafío porque no se ha desarrollado una técnica para la preparación de neutrófilos completamente activos marcados con sondas fluorescentes o genéticamente modificadas para expresar proteínas fluorescentes de manera estable. Además, las condiciones favorables para el crecimiento de biopelículas difieren de las de los neutrófilos. Cuando se resuelvan estos problemas técnicos, iCBiofilm podrá usarse para realizar imágenes de células vivas de las interacciones biopelícula-neutrófilos.

Además, todas las biopelículas fotografiadas aquí se formaron en condiciones estáticas in vitro. Los experimentos futuros deberían centrarse en determinar las estructuras finas de las biopelículas formadas in vivo (p. ej., biopelículas formadas en las superficies de dispositivos y tejidos médicos) y en condiciones semi in vivo (utilizando un sistema de celda de flujo) y en entornos naturales. Por lo tanto, nuestros hallazgos pueden contribuir al avance de la investigación de biopelículas y utilizarse como herramienta para identificar o calificar enfoques antibiopelículas en entornos clínicos e industriales.

Las cepas de S. aureus, S. epidermidis, E. coli y C. albicans utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 1. E. coli se cultivó en caldo de lisogenia (LB) (1 % de triptona, 0,5 % de extracto de levadura, 1% NaCl) (Kanto Chemical Co., Inc., Tokio, Japón) y YESCA (1% casaminoácidos, 0,1% extracto de levadura). S. aureus y S. epidermidis se cultivaron en medio BHI (Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.). Estas bacterias se cultivaron a 37 °C a menos que se indique lo contrario. Si era necesario, el medio se complementó con un 1% de glucosa para promover la formación de biopelículas o con antibióticos para seleccionar transformantes.

C. albicans se cultivó en una placa de levadura-peptona-dextrosa (YPD) (1 % de extracto de levadura, 2 % de peptona, 2 % de dextrosa y 2 % de agar), RPMI 1640 (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU. ) tamponado con MOPS (pH 7,0) (RPMI-MOPS), o medio de sLee [NaCl al 0,5 % (FUJIFILM Wako Chemicals, Tokio, Japón), sulfato de amonio al 0,5 % (FUJIFILM Wako Chemicals), fosfato dibásico de potasio al 0,25 % (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón), 0,13% l-leucina (Nacalai Tesque), 0,1% l-lisina (Kanto Chemical Co.), 0,05% l-alanina (FUJIFILM Wako Chemicals), 0,05% l-fenilalanina (FUJIFILM Wako Chemicals), 0,05 % l-prolina (FUJIFILM Wako Chemicals), 0,05% l-treonina (Kanto Chemical Co.), 0,02% sulfato de magnesio (FUJIFILM Wako Chemicals), 0,01% l-metionina (FUJIFILM Wako Chemicals), 0,007% l-ornitina (Nacalai Tesque), 0,007 % de l-arginina (FUJIFILM Wako Chemicals), 0,0001 % de D-biotina (Nacalai Tesque), 0,1 mM de sulfato de zinc (FUJIFILM Wako Chemicals) y 1,25 % de dextrosa (FUJIFILM Wako Chemicals)].

El kit de prueba SeeDB2, el kit de prueba SCALEVIEW-S, la solución deScale y el kit de prueba CUBIC se adquirieron de FUJIFILM Wako Chemicals. El kit de prueba SeeDB2 contenía SeeDB2G [56,2 % (p/p) de iohexol, Tris-HCl 10 mM (pH 7,6) y EDTA 0,267 mM]24, SeeDB2S [70,4 % (p/p) de iohexol, Tris-HCl 10 mM (pH 7.6), y EDTA]24 0,267 mM, saponina (en polvo) y solución esterilizada de PBS (-). El kit de prueba SCALVEIW-S contenía las soluciones SCALEVIEW-S0, SCALEVIEW-S1, SCALEVIEW-S2, SCALEVIEW-S3, SCALEVIEW-S4 y SCALEVIEW-SMt. El kit CUBIC Trail contenía solución ScaleCUBIC-1, solución ScaleCUBIC-2, solución de montaje 1 y solución de montaje 2. Iohexol [Omnipark 350; 56,2% (p/p)] se compró a Daiichi Sankyo (Tokio, Japón). Yodixanol [Optiprep; 60,0 % (p/v)] se adquirió de Thermo Fisher Scientific. Ioversol [Optiray 350; 74,1% (p/v)] se compró a Guerbet (Villepinte, Francia). Iopromida [Iopromida 370; 76,9% (p/v)], Iopamidol [Iopamidol 370; 75,6% (p/v)] y diatrizoato [Urografin 60%; 47,2 % (p/v)] se adquirieron de Fujifilm Wako Chemicals, Hikari Pharmaceutical Co. (Tokio, Japón) y Bayel (Tokio, Japón), respectivamente. Cuando fue necesario, los reactivos se diluyeron con agua bidestilada (DDW).

Con A-Alexa 594, WGA-Alexa 647, NucBlue Fixed Cell ReadyProbe Reagent (DAPI), FilmTracer FM 1–43 Green Biofilm Cell tinción (FM1-43), MitoTracker Deep Red FM y FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit fueron adquirido en Thermo Fisher Scientific. El blanco de calcoflúor y ThT se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) y AAT Bioquest (Sunnyvale, CA, EE. UU.), respectivamente.

El anticuerpo policlonal de conejo anti-Eap fue desarrollado por Scrum (Tokio, Japón)25. Eurofins Genomics (Tokio, Japón) desarrolló el anticuerpo policlonal anti-SasG de conejo9 y los anticuerpos policlonales anti-SasG de ratón. El anticuerpo anti-Curli de conejo fue desarrollado por Scrum (Tokio, Japón), y el anticuerpo monoclonal anti-ADNbc de ratón se adquirió de Abcam (Cambridge, MA, EE. UU.)33. La IgG anti-ratón conjugada con Alexa 405, la IgG anti-conejo de cabra conjugada con Alexa 488, la IgG anti-conejo de cabra conjugada con Alexa 647 y la IgG anti-ratón de cabra conjugada con Alexa 647 se adquirieron de Thermo Fisher Scientific. El anticuerpo del locus G del complejo antígeno 6 anti-linfocitos de ratón conjugado con Alexa Fluor 647 (anti-Ly-6G-Alexa 647) se adquirió de BioLegend Japan, Inc. (Tokio, Japón).

Para construir la fusión transcripcional Eap-mScarlet-1 en S. aureus MR23, se utilizó un fragmento de ADN que contiene el fragmento de 500 pb del extremo 3' de MR23 eap, un sitio de unión a ribosomas, el gen mScarlet-1 con su codón optimizado para S .aureus, y Eurofins (Tokio, Japón) generó y clonó el fragmento de 500 pb de la región aguas abajo de MR23 eap (eap-mScarlet-1) en pEX-K4J2. El plásmido resultante se denominó pEX-eap-mS1 (Tabla complementaria 1). El ADN insertado se amplificó utilizando pEX-eap-mS1 como plantilla, ADN polimerasa KOD Plus Neo (Toyobo, Osaka, Japón) y los cebadores eap-mScarlet-pKOR1-F y eap-mScarlet-pKOR1-R (Tabla complementaria 2). ). El ADN amplificado se purificó con el kit de purificación de ADN QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania) y se clonó en pKOR146 usando BP Clonase Enzyme Mix (Life Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El plásmido resultante se denominó pKOR1-eap-mS1 (Tabla complementaria 1).

Para construir la fusión transcripcional SasG-mNeonGreen en S. aureus MR23, un fragmento de ADN que contiene el fragmento de 500 pb del extremo 3' de MR23 sasG, un sitio de unión a ribosomas, el gen mNeonGreen con su codón optimizado para S. aureus, y Eurofins (Tokio, Japón) generó y clonó el fragmento de 500 pb de la región aguas abajo de MR23 sasG en pEX-K4J2. El plásmido resultante se denominó pEX-sasG-mNG (Tabla complementaria 1). El ADN insertado se amplificó utilizando pEX-sasG-mNG como plantilla, ADN polimerasa KOD Plus Neo (Toyobo, Osaka, Japón) y los cebadores sasG-mNeon-pKOR1-F y sasG-mNeon-pKOR1-R (Tabla complementaria 2). ). El ADN amplificado se clonó en pKOR146 utilizando la mezcla de enzimas clonasa BP según las instrucciones del fabricante. El plásmido resultante se denominó pKOR1-sasG-mNG (Tabla complementaria 1).

Utilizando pKOR1-eap-mS1 y pKOR1-sasG-mNG, se realizó el intercambio alélico9,33. Brevemente, estos plásmidos se transformaron en S. aureus RN4220 mediante electroporación47. Los plásmidos purificados a partir de RN4220 se transformaron adicionalmente en la cepa objetivo MR23 Δspa Δsbi mediante electroporación, y los genes mScarlet-1 y mNeonGreen se insertaron en el genoma mediante recombinación homóloga46. Las cepas construidas se denominaron MR23 Δspa Δsbi eap-mS1, MR23 Δspa Δsbi sasG-mNG y MR23 Δspa Δsbi eap-mS1 sasG-mNG (Tabla complementaria 1).

Se realizó la formación de biopelículas en placas de poliestireno de 96 pocillos9,33. Las cepas de S. aureus MR4 y MR23 y la cepa SE21 de S. epidermidis se cultivaron en BHI (2 ml) a 37 ° C durante 16 a 20 h. Los cultivos se diluyeron 1:1000 en BHIG y las suspensiones (200 μl) se cultivaron a 37 °C durante 24 h en placas de fondo plano de poliestireno de 96 pocillos (Corning, Corning, NY). Las biopelículas resultantes se utilizaron para examinar los efectos de los reactivos de limpieza sobre la densidad óptica y la estabilidad.

Después de la formación de biopelículas en placas de poliestireno de 96 pocillos como se describe anteriormente, se eliminaron los medios de cultivo y las células bacterianas planctónicas y se añadió reactivo de limpieza (100 μL) a las concentraciones indicadas (consulte "Reactivos de limpieza de biopelículas") o PBS a las biopelículas. Para garantizar la precisión experimental, se utilizaron al menos tres pocillos por reactivo. Posteriormente, se midieron las densidades ópticas a 595 nm y 492 nm utilizando un lector de microplacas Infinite F200 Pro (Tecan, Männedorf, Suiza). Luego se retiraron los reactivos de limpieza y las biopelículas se lavaron cuidadosamente una vez con PBS (100 μl). Las biopelículas residuales se tiñeron con cristal violeta al 0,05% (FUJIFILM Wako Chemicals) (50–100 μL) durante 10 minutos a 25 °C. Después de la tinción, cada biopelícula se lavó una vez con 100 μL de PBS y su masa se cuantificó midiendo la absorbancia a 595 nm utilizando el lector de microplacas Infinite F200 Pro.

Los cultivos nocturnos de cepas de S. aureus cultivadas en BHI a 37 °C durante 16 a 20 h se diluyeron 1:1000 en BHIG y se incubaron a 37 °C durante 24 h en placas con fondo de vidrio (35 mm de diámetro; Matsunami Glass, Osaka , Japón). Para probar el efecto del iohexol en la formación de biopelículas, se formaron biopelículas de S. aureus en BHIG que contenía 28,1% (p/p) de iohexol a 37 °C durante 24 h en un plato con fondo de vidrio. Las biopelículas se fijaron con GA al 1% (p/v), PFA al 4% o ambos en PBS durante 30 minutos a 25 °C. Después de retirar las soluciones fijadoras, las biopelículas se lavaron tres veces con DDW y las biopelículas fijadas se tiñeron con sondas fluorescentes o anticuerpos.

Para la tinción fluorescente de células de S. aureus, las biopelículas se tiñeron con ThT 25 μM, o FM1-43 5 μg/mL, que tiñe las membranas bacterianas, durante al menos 30 minutos a 25 °C. Cuando fue necesario, las biopelículas se tiñeron con DAPI, que tiñe el ADN en células fijadas. Para la identificación de polisacáridos extracelulares, se tiñeron biopelículas de S. aureus con WGA-Alexa 647 a 25 °C durante más de 3 h o a 4 °C durante la noche.

Para la tinción por inmunofluorescencia, se utilizó S. aureus MR23 Δspa Δsbi33. Además, se utilizaron los derivados Δspa Δsbi Δeap, Δspa Δsbi eap-mS1, MR23 Δspa Δsbi sasG-mNG y Δspa Δsbi eap-mS1 sasG-mNG. Las biopelículas de S. aureus fijadas con PFA se incubaron en tampón de bloqueo [albúmina sérica bovina (BSA) al 3%, Triton X-100 al 0,05%, PBS, pH 7,4] durante 30 minutos a 25 °C. Posteriormente, las biopelículas se incubaron con anticuerpo de conejo anti-Eap o anticuerpo de conejo anti-SasG (diluido 1:200 en tampón de bloqueo). Después de la incubación durante 3 h a 25 °C, las biopelículas se lavaron tres veces con tampón de bloqueo y se incubaron con IgG anti-conejo de cabra conjugada con Alexa 647 o IgG anti-conejo de cabra conjugada con Alexa 488 (diluida 1:200 en tampón de bloqueo). , respectivamente, a 4 °C durante la noche. Las biopelículas se lavaron tres veces con PBS y se fijaron con 1% de GA y 4% de PFA en PBS durante 30 min a 25 °C. Luego, las células de biopelícula se tiñeron con 5 μg/ml de FM1-43 durante al menos 30 minutos a 25 °C o durante la noche a 4 °C. Para la detección de ADNe, se utilizaron anticuerpo monoclonal anti-ADNbc de ratón y anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con Alexa 647 siguiendo el mismo procedimiento.

Los cultivos nocturnos de E. coli BW25113 cultivados en LB a 30 °C se diluyeron 1:1000 en YESCA y se cultivaron a 25 °C durante 5 días en placas con fondo de vidrio (35 mm de diámetro; Matsunami Glass). Las placas se colocaron inclinadas para formar una interfaz aire-líquido propicia para la formación de biopelículas de E. coli40. Las biopelículas resultantes se fijaron en PFA al 4% en PBS durante 30 min a 25 °C. Después de retirar la solución fijadora, las biopelículas se lavaron tres veces con PBS y se incubaron en tampón de bloqueo (BSA al 3%, Triton X-100 al 0,05%, PBS, pH 7,4) a 25 °C durante 1 h. Luego, las biopelículas se incubaron con anticuerpo anti-Curli (diluido 1:100 en tampón de bloqueo) a 25 °C durante 3 horas o se dejaron sin tratar como control. Después de lavar tres veces con tampón de bloqueo, las biopelículas se incubaron adicionalmente con IgG anti-conejo de cabra conjugada con Alexa 647 (diluida 1:100 en solución de bloqueo) a 4 °C durante la noche. Después de lavar tres veces con PBS, las biopelículas y los anticuerpos se fijaron con 1% de GA y 4% de PFA en PBS a 25 °C durante 30 minutos, se lavaron tres veces con PBS y se almacenaron en PBS que contenía 10 µg/ml de FM1-43 a 4°C hasta su uso.

C. albicans SC5314 se cultivó en placas YPD a 25 °C durante 3 días y luego se suspendió en RPMI-MOPS. Se cultivaron muestras de dos mililitros que contenían aproximadamente 106–107 UFC/ml de células de C. albicans a 37 °C durante 48 h en placas con fondo de vidrio de 35 mm (Matsunami Glass). También se formó una biopelícula de C. albicans según el modelo de Douglas48 con ligeras modificaciones. Brevemente, se cultivaron células planctónicas de C. albicans SC5314 en 5 ml de medio de Lee en un tubo de ensayo a 37 °C durante 48 h con agitación a 150 rpm, luego se diluyeron en RPMI-MOPS a 107 UFC/ml. La suspensión de células planctónicas se añadió a una placa con fondo de vidrio de 35 mm y se incubó estáticamente a 37 °C durante 1,5 h para permitir la adherencia a la superficie del vidrio. Después de retirar las células no adherentes y reemplazar el medio, las células se incubaron a 37 °C durante 1,5 h con balanceo suave (desviación de 10 °, 18 ciclos/min). La placa se lavó una vez con 1 ml de RPMI-MOPS para eliminar las células no adherentes y débilmente adherentes. Las células adherentes residuales se incubaron en 3 ml de RPMI-MOPS a 37 °C durante 48 h para formar una biopelícula espesa. La biopelícula resultante se fijó con PBS que contenía 1% de GA y 4% de PFA durante 30 minutos a 25 °C, se lavó tres veces con DDW y se tiñó con FM1-43 (5 μg/mL en PBS), Con A-Alexa 594. (25 μg/mL en PBS) o Calcofluor White (1 mg/mL) en la oscuridad a 4 °C hasta su uso.

Después de eliminar los tintes fluorescentes, las biopelículas se empaparon en los reactivos de limpieza indicados, soluciones de montaje o PBS como control y se visualizaron usando un microscopio CLSM.

Las biopelículas se formaron en BHIG a 37 °C durante 24 h en placas con fondo de vidrio de 35 mm y se fijaron con PBS que contenía 4% de PFA a 25 °C durante 30 min. Si las biopelículas son frágiles, se recomienda la fijación con 4% de PFA y 1% de GA. Después de lavar tres veces con PBS, las biopelículas se tiñeron con sondas fluorescentes (FM1-43, anticuerpos marcados con fluorescencia, lectinas marcadas con fluorescencia, etc.). Las biopelículas teñidas se empaparon en uno de los medios compatibles con RI disueltos en DDW. Como primera opción, se recomienda el uso de iohexol al 35,2% (p/p) para eliminar biopelículas, ya que era aplicable a una amplia gama de biopelículas y permitía una eliminación muy rápida. Es de destacar que el medio de coincidencia de RI se puede cambiar de manera flexible. Si la limpieza es insuficiente, se debe optimizar su concentración para analizar las biopelículas. Además, si las biopelículas fijas son frágiles y están dañadas por el iohexol, se recomienda utilizar 45% (p/v) de iodixanol en lugar de iohexol. Finalmente, CLSM tomó imágenes de las muestras como se describe a continuación.

Se utilizó el kit de prueba SeeDB2 (FUJIFILM Wako Chemicals) para realizar la limpieza de biopelículas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, la biopelícula fijada con PFA de S. aureus MR23 se permeabilizó con una solución de permeabilización compuesta de PBS (pH 7,4) y saponina al 2% (p/v) a 25 °C durante la noche. Luego, la biopelícula se eliminó incubando con solución limpiadora 1 [2% (p/v) de saponina, 1/3 de solución SeeDB2G y 2/3 DDW] a 25 °C durante 24 h, solución limpiadora 2 [2% (p.p.) /v) saponina, 1/2 solución SeeDB2G y 1/2 DDW] a 25 °C durante 6 h, solución aclaradora 3 [2% (p/v) de saponina y solución SeeDB2G] a 25 °C durante 24 h, y luego solución de limpieza 4 [saponina al 2% (p/v) y solución SeeDB2S suplementada con ThT 25 μM] a 25 °C durante 24 h. Finalmente, la biopelícula se empapó en una solución SeeDB2S suplementada con ThT 25 μM y se examinó mediante CLSM.

Las biopelículas de S. aureus MR23 fijadas con PFA se eliminaron mediante otros métodos de limpieza de tejidos como se describe en la Nota complementaria 1.

Se mantuvieron ratones C57BL/6 J (CLEA Japan, Inc., Tokio, Japón) en condiciones libres de patógenos específicos en la Facultad de Medicina de la Universidad de Jikei, Japón.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Jikei, Japón, y se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones aprobadas.

Se sacrificaron seis ratones C57BL/6 J (ratones machos y hembras de entre 8 y 12 semanas de edad) siguiendo el protocolo de la institución aprobado por el comité de cuidado de animales, y se recolectaron células de la médula ósea de los fémures. Se usó PBS que contenía BSA al 0,1% para lavar los fémures. Las células de la médula ósea se sedimentaron mediante centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos a 4 °C y se suspendieron en 1 ml de tampón de lisis ACK (Thermo Fisher Scientific) a 25 °C durante 2 minutos para lisar los glóbulos rojos. Después de agregar 9 ml de PBS que contenía BSA al 0,1%, las células se sedimentaron mediante centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos a 4 °C. El centrifugado resultante se suspendió en 6 ml de PBS y se colocó en capas sobre 4 ml de Histopaque-1077 y 4 ml de Histopaque-1119 (Sigma). Luego, las células se centrifugaron a 700 × g, sin aceleración ni desaceleración, durante 30 min a 25 °C. Se recogieron neutrófilos de la interfaz entre Histopaque-1077 e Histopaque-1119 y se lavaron una vez con PBS que contenía BSA al 0,1%. Finalmente, se suspendieron los neutrófilos en medio RPMI 1640 y se contó el número de células bajo un microscopio.

Las biopelículas de 24 h de S. aureus MR23 formadas en placas con fondo de vidrio como se describe anteriormente (consulte “Tinción fluorescente de biopelículas para CLSM”) se lavaron dos veces con 1 ml de PBS. Luego se incubaron a 37 °C durante 30 minutos en CO2 al 5 % con neutrófilos de ratón (4 x 106 células/ml) y se suspendieron en 0,5 ml de medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (v/v). ; Nichirei Bioscience. Inc., Tokio, Japón) y suero de ratón inactivado por calor al 1% (v/v). Después de la eliminación de las células y los medios no unidos, las biopelículas y los neutrófilos se fijaron con PFA al 4% a 37 °C durante 30 minutos y se lavaron dos veces con PBS. Las muestras se incubaron con 0,5 ml de anti-Ly-6G-Alexa 647 (diluido 1:500 en PBS que contenía FBS inactivado por calor al 2 % (v/v) y NaN3 al 0,05 %) a 4 °C durante la noche en la oscuridad. Después de lavar tres veces con PBS, las muestras se tiñeron adicionalmente con FM1-43 en PBS a 25 °C durante al menos 30 minutos o a 4 °C durante la noche en la oscuridad. Finalmente, las biopelículas y los neutrófilos se empaparon en las soluciones indicadas y se observaron mediante CLSM, como se describe a continuación.

Se observaron estructuras tridimensionales de biopelículas utilizando un microscopio de barrido láser confocal LSM880 (Carl Zeiss) con alfa Plan-Apocromático ×100/1,46 Óleo DIC M27 Elyra, Plan-Apocromático ×63/1,4 Óleo DIC M27, Plan-Apocromático ×40/1,3 Lentes de objetivo Oil DIC UV-IR M27, C-Apocromático ×40/1,2 W Korr FCS M27, Plan-Apocromático ×20/0,8 M27e y Plan-Apocromático ×10/0,45 M27. La adquisición de imágenes se realizó a 405 (para DAPI), 488 (para ThT, FM1-43 y Alexa 488), 561 (para Alexa 594) y 633 nm (para Alexa 647). Se adquirieron imágenes de alta resolución de biopelículas en el microscopio LSM880 con una unidad de superresolución Airyscan (Carl Zeiss). Las imágenes se capturaron utilizando un objetivo de ×100 con zoom digital ×2, un objetivo de ×63 con zoom digital de ×1,8 a ×5, lentes de objetivo ×40 con zoom digital de ×1 a ×3 y un objetivo de ×20. con zoom digital de ×1 a ×2, y las secciones z se recogieron a intervalos de 0,185 a 2 μm.

Se cultivó S. epidermidis SE21 en BHI (2 ml) a 37 °C durante la noche. El cultivo se diluyó a 1:100 en BHIG y la suspensión se vertió en un plato con fondo de vidrio de 35 mm (Matsunami Glass). Después de la preincubación a 37 °C durante 4 h, se eliminaron el medio y las células planctónicas, y las células adheridas se lavaron una vez con BHIG. Posteriormente, se añadió a la placa BHIG (2 ml) que contenía 30,0 % (p/v) de yodixanol y ThT 25 µM. Las imágenes de células vivas se realizaron en el microscopio de barrido confocal LSM880 con una lente objetivo Plan-Apochroma ×40/1.3 Oil DIC UV-IR M27 y un módulo de enfoque automático. Durante la obtención de imágenes, la temperatura de la placa de cultivo de biopelículas se mantuvo a 37 °C utilizando una incubadora de jaula grande y una incubadora de etapa superior. Las imágenes 3D se capturaron cada 30 minutos y se tomaron pilas Z a intervalos de 1,216 μm. Como control, se realizaron imágenes de células vivas utilizando BHIG suplementado con ThT 25 μM, pero sin iodixanol. Además, se realizaron imágenes de células vivas utilizando el LSM880 en modo de reflexión. En este caso, no se añadió ningún colorante fluorescente a BHIG o BHIG que contenía 30,0 % (p/v) de yodixanol y las imágenes se adquirieron a 633 nm.

Se tomaron imágenes de biopelículas vivas de S. aureus y C. albicans utilizando el microscopio THUNDER DMi8 como se describe en la Nota complementaria 1.

Las estructuras tridimensionales se reconstruyeron utilizando el software de microscopio ZEN 3.0 SR negro (64 bits) para microscopía ZEISS (Carl Zeiss) e Imaris (Bitplane, Belfast, Reino Unido). Para la representación de imágenes tridimensionales, se utilizó el modo de proyección máxima para la comparación de tratamientos (Fig. 1 y Fig. 2 complementaria). Los rangos dinámicos de las imágenes se ajustaron utilizando la función Min/Max, que puede ayudar a automatizar y optimizar el rango de visualización para cada imagen. En los demás casos se utilizó el modo transparente para mostrar imágenes estereoscópicas, en las que se calculó una imagen tridimensional con efecto transparente.

Las imágenes de células vivas tomadas con el microscopio Leica THUNDER DMi8 se procesaron utilizando el sistema de imágenes THUNDER (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) en modo SVCC.

Las imágenes ASEM se registraron utilizando el sistema ClairScope ASEM (JASM-6200, JEOL, Ltd, Tokio, Japón) 33,49 como se describe en la Nota complementaria 1.

El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism Ver. 9 para el sistema operativo Windows (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Se utilizó la prueba t de Student o el análisis de varianza unidireccional con la prueba post hoc de Dunnett para determinar si los grupos presentaban diferencias estadísticamente significativas en los efectos de las soluciones de inmersión en comparación con las muestras de control no tratadas. Todos los experimentos fueron realizados al menos tres veces. Los tamaños de muestra se indican en las leyendas de las figuras y en los Datos complementarios 1. Para todos los análisis, P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos de origen subyacentes a los gráficos presentados en las figuras están disponibles en Datos complementarios 1 o pueden obtenerse del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Los autores agradecen a la Sra. Naoko Toda por su apoyo experimental, al Dr. Koji Hayashizaki por la preparación de neutrófilos de ratones, al Dr. Ken-ichi Okuda por la preparación de nisina A, a los Dres. Mamiko Niki y Yukihiro Kaneko por sus consejos sobre las biopelículas de C. albicans, al Dr. Jean-Marc Ghigo por una revisión crítica del manuscrito y a todos los miembros del Departamento de Bacteriología de la Universidad de Jikei por su estimulante debate. Este trabajo fue financiado en parte por una subvención para la investigación científica (B) (no. 20H02904 a SS) y una subvención para la investigación científica en áreas innovadoras (Ecología Post-Koch, no. 22H04889 a SS) de JSPS, JST ERATO (no. JPMJER1502 a SS) y la Beca de Investigación de la Fundación Sumitomo (a SS) y el Fondo de Investigación de Priorización Estratégica de la Universidad Jikei.

Departamento de Bacteriología, Facultad de Medicina de la Universidad Jikei, 3-25-8 Nishi-Shimbashi, Minato-ku, Tokio, 105-8461, Japón

Shinya Sugimoto y Yuki Kinjo

Centro Jikei para la ciencia y la tecnología de biopelículas, Facultad de Medicina de la Universidad Jikei, 3-25-8 Nishi-Shimbashi, Minato-ku, Tokio, 105-8461, Japón

Shinya Sugimoto y Yuki Kinjo

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SS planificó el proyecto, diseñó y realizó los experimentos y analizó los datos. YK apoyó todos los aspectos del proyecto. SS escribió el artículo con aportaciones de YK.

Correspondencia a Shinya Sugimoto.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Wendy Mok y Zhijuan Qiu.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Sugimoto, S., Kinjo, Y. Eliminación instantánea de biopelículas (iCBiofilm): un enfoque óptico para revisar las imágenes de biopelículas bacterianas y fúngicas. Común Biol 6, 38 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04396-4

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Recibido: 14 de marzo de 2022

Aceptado: 21 de diciembre de 2022

Publicado: 23 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04396-4

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